Glycosylation engineering in yeast Humanitzaci

1
Glycosylation engineering in yeastHumanització
del llevat per producció de proteïnes
terapèutiques
Albert Font Inglès
2
Mercat de les proteïnes terapèutiques

• És un mercat que ha crescut ràpidament des de que
  va néixer fa uns 30 anys.
• Actualment estan aprovades 140 proteïnes dús
  farmacèutic als mercats dels EUA i Europa, i nhi
  han 500 més en proves.
• En el 2003 el mercat de les proteïnes
  recombinants terapèutiques estava valorat en 30
  bilions de .
• Avui en dia una quarta part dels nous fàrmacs que
  saproven per lús terapèutic estan basats en
  proteïnes, i la majoria delles són
  glicoproteïnes (bàsicament anticossos
  monoclonals)

Sources BiotechGuide 2007
3
Importància de la glicosilació

• La N-glicosilació afecta
• La vida mitja en plasma
• - Degut al PM i a la càrrega neta
• - Activació de sistemes de clearance
  lectin-mediated receptor (asialoglicoproteins o
  proteïnes amb manoses terminals)
• - LEritropoietina (EPO) necessita de làcid
  siàlic per mantenir-se estable en plasma
• LEspecificitat de teixit
• LActivitat biològica
• - Tenen efecte en leficàcia de la interacció amb
  els receptors
• - Les immunoglobulines necessiten de
  N-glicosilacions per la interacció amb el
  receptor

4
Fonts de les glicoproteïnes

• Tradicionalment shan derivat de fonts humanes o
  animals (human serum albumin, insulin)
• Problema Contaminació viral i purificació
• Sistemes recombinants clàssics - Cèllules de
  mamífer
• -
  Bactèria
• -
  Llevat
• -
  Cèllules dinsecte
• 
  - Altres
• Claus avaluadores dun hoste dexpressió
• Cost de fabricació i purificació
• Habilitat per controlar el producte final
  (incloses modificacions post-traduccionals)
• El temps de desenvolupament del gen a la proteïna
  purificada
• Royalties

5
Sistemes recombinants

• Mammalian Cell cultures
• CHO cells (Chinese Hamster Ovary )
• Avantatges
• Gran Know-how i un procés fàcilment escalable
• Capacitat inherent de glicosilar com els mamífers
• Desavantatges
• Costos molt elevats de producció
• Facilitat dexpansió de virus, prions
• Les seves glicoproteïnes mostren un elevat grau
  dheterogeneïtat en la glicosilació, resultant en
  molta varietat del producte de lot a lot.
• Insect Cell lines
• Shan utilitzat per lexpressió de varies
  glicoproteïnes
• No fan N-glicosilacions de tipus complexa
• Alguns residus de paucimannose, mannose etc fan
  baixar la vida mitja
• Algunes línies cellulars afegeixen a-1,3-fucose
  glicans, altament immunogèniques

6
Sistemes recombinants

• Plantes Transgèniques
• Bàsicament tenen el problema de la falta de
  galactosa i àcid siàlic, i la presència dalguns
  sucres immunogènics com xilosa o a-1,3-fucosa.
• Animals Transgènics
• Shan expressat diferents glicoproteïnes
  (inclosos anticossos monoclonals)
• Les N-glicosilacions tenen moltes manoses i amb
  baix contingut dàcid siàlic (comparat amb
  humans)
• Llevat (S. cerevisiae, P. pastoris )
• Sistema robust i en el qual es disposen
  dinnumerable eines genètiques
• Escalable fins a 100 m3
• Fan N-glycosilació, però afegint moltes manoses
  (Hypermannosylation)

7
Comparativa entre les rutes de glicosilació
humana i de llevat
8
Humanització del llevatPrimeres temptatives

• Així doncs, humanitzar la maquinària de
  glicosilació de Pichia Pastoris requerirà
• Knockout de diferents gens implicats en les vies
  endògenes del llevat (manosiltransferases)
• Recreació de la seqüència natural de glicosilació
  en humans (manosidases, glicosiltransferases)

9
Humanització del llevat

• LAny 2000 Tillman Gerngross es proposa
• Desenvolupar mètodes per localitzar en orgànuls
  específics enzims daltres especies relacionats
  en la glicosilació
• Desenvolupar mètodes per veure si aquests enzims
  són actius en la seva nova localització
• Desenvolupar tècniques fiables dscreening per
  identificar les soques que hagin adquirit la
  habilitat
• En aquest article desenvolupen dues eines
  bàsiques per sobrepassar els reptes anteriors
• Una llibreria genètica, generant centenars de
  constructes de fusió
• Screening dalt rendiment, permetent analitzar un
  gran nombre de soques en parallel
• Les llibreries consistien en arrays de diferents
  proteïnes de fusió, on cadascuna estava formada
  per un pèptid senyal de localització i un domini
  catalític

10
Humanització del llevat

• Knockout del gen och1 (a-1,6-manosiltransferasa)
• És lenzim encarregat diniciar la
  hipermanosilació.
• La proteïna K3 secretada com a reporter protein.
• Expressió del constructe de fusió
  a-1,2-manosidasa (MNS I) en una soca ? och1
• Obtenció dun N-glicà amb pes consistent amb
  Man5GlcNAc2
• El clon que millor rendiment donava era aquell
  amb el domini catalític de C. elegans fusionada
  amb MNS1 de S. cerevisiae
• Expressió del constructe dexpressió GnTI en una
  soca ? och1 amb activitat a-1,2-manosidasa
• La fusió de GnTI humana permetia el pas de
  Man5GlcNAc2 a GlcNAcMan5GlcNAc2
• En aquesta reacció es requereix de UDP-GlcNAc com
  a substrat en el golgi, i per assegurar nivells
  suficients es va clonar un transportador de
  UDP-GlcNAc de Kluyveromyces lactis

11
Humanització del llevatPresentació

• En aquest treball es presenta una alternativa a
  lús de la manosidasa II, interferint en
  lassemblatge de loligosacàrid en el pas dunió
  al grup dolichol
• ALG3 és lenzim encarregat daddicionar la
  sisena manosa al precursor durant lassemblatge
  de loligosacàrid al RE.
• La deleció de alg3 en P. pastoris juntament amb
  lexpressió localitzada de a-1,2 manosidasa
  hauria de generar Man3GlcNAc2, un intermediari
  sintètic ideal per construir una ruta de
  glicosilació artificial. Schachter and co-workers
  ja varen demostrar que aquesta forma serveix com
  a substrat per la GnTI.

12
Humanització del llevatProcediment I

• Knockout del gen alg3 en una soca ? och1 amb
  activitat a-1,2-manosidasa (MNS I) i
  N-acetilglucosaminotransferasa (GnTI)
• En mamífers el pas de GlcNAcMan5 a GlcNAcMan3 es
  fa mitjançant la manosidasa II
• En aquest cas al tenir un KO sobre alg3 els
  oligosacàrids del RE tan sols contindrien 5
  manoses, que amb lacció de a-1,2-manosidasa en
  el golgi es quedaria amb 3 manoses

13
Humanització del llevatProcediment II

• Producció de glicans complexes Expressió
  funcional de GnTII
• En mamífers lestructura generada per la MnsII
  serveix com a substrat per la GnTII
• Expressant el domini catalític de GnTII en els
  primers passos del Golgi saconsegueix eliminar
  laddició da-1,2-manoses, permetent assolir
  GlcNAc2Man3GlcNAc2

14
Humanització del llevatProcediment III

• Transferència in vivo de Galactosa
• En estudis previs es demostra que P. pastoris és
  incapaç no tan sols de transferir galactosa, sinó
  de generar UDP-galactosa com a substrat
• Dissenyen una proteïna de fusió de 3 subunitats
  diferents sota control del promotor GAP
• 36 aa de ScMnn2 com a pèptid senyal
• La UDP-galactosa 4-epimerasa sencera (S. pombe)
• GalT I humana sense els primers 43 aa

• Per tant, sembla que leliminació del gen alg3,
  en combinació amb ladequada localització de
  MNS I, GnTI, GnTII i la triple proteïna de fusió
  per laddició de galactosa ens dóna uns sucres de
  tipus complex que en molts casos són iguals que
  els dhumans excepte per aquelles glicoproteïnes
  que requereixen dàcid siàlic.

15
Humanització del llevatPas final Sialització

• La sialització final de la glicosilació
  representava el repte més important
• P. pastoris és incapaç de produir cytidine
  monophosphate (CMP)-sialic acid
• P. pastoris no té el transportador perquè
  CMP-sialic entri al Golgi
• P. pastoris li manca la sialyl-transferasa per
  transferir el siàlic al residu de galactosa
• Per assolir la sialització es va partir de les
  soques capaces dincorporar galactosa als residus
  i shi van clonar 5 enzims amb lús de codó
  optimitzat en un sol vector
• UDP-N-acetylglucosamine-2-epimerase/N-acetylmannos
  amine kinase (GNE) H. sapiens
• N-acetylneuraminate-9-phosphate synthase (SPS) H.
  sapiens
• CMP-sialic acid synthase (CSS) H. sapiens
• CMP-sialic acid transporter (CST) M. musculus
• Llibreria de sialiltransferases quimèriques
  unides a un domini transmembrana de llevat (ST)
• Amb aquesta estratègia aconseguien que el 90,5
  de la EPO recombinant portes a estructures de
  glicosilació amb àcid siàlic.

16
Bibliografia

• Challenges in therapauric glycoprotein production
  Natarajan Sethuraman Current Opinion in
  Biotechnology 2006
• Advances in the production of human therapeutic
  proteins in yeasts and filamentous fungi Tillman
  U Gerngross Nature Biotechnology
• Engineering of an artificial glycosylation
  pathway blocked in core oligosaccharide assembly
  in the yeast Pichia Pastoris production of
  complex humanized glycoproteins with terminal
  galactose P. Bobrowicz et al., Glycobiology 2004
• Use of combinatorial genetic libraries to
  humanize N-linked glycosylation in the yeast
  Pichia pastoris Choi et al., PNAS 2003
• Humanization of yeast to produce complex
  terminally sialylated glycoproteins Hamilton et
  al., Science 2006
• Glycosylation engineering in yeast the advent of
  fully humanized yeast Hamilton et al., Current
  opinion in Biotechnology 2007