Sn

1
J. Kolár - Biologické rytmy a fotoperiodizmus
rostlin
10 Mechanizmy fotoperiodické indukce kvetení
2
(No Transcript)
3

• Fotoperiodická indukce kvetení
• konvencní fyziologie a biochemie formulovala
  základní koncepce, týkající se mechanizmu
  fotoperiodické kvetní indukce
• neobjasnila však podrobnosti dvou klícových
  procesu
• merení délky dne/noci pomocí cirkadiánních rytmu
  (externí, nebo interní koincidence?)
• prenos kvetního stimulu z listu do vzrostného
  vrcholu (existuje florigen? o jakou látku jde?)

4

• Fotoperiodická kvetní indukce - místo vnímání
  fotoperiodického signálu
• indukcní fotoperiode musí být vystaveny listy
  expozice samotného apexu je neúcinná
• délka dne je tedy vnímána v listech
• u mnoha druhu k vyvolání kvetení postacuje, aby
  byla indukcní délce dne vystavena jen malá cást
  celkové listové plochy jedince

schéma klasického experimentu dokazujícího
vnímání délky dne v listech (z Vince-Prue 1975)
5

• Florigen
• fotoperiodický signál je prijímán v listech, ale
  kvety se tvorí na vzrostném vrcholu
• Z listu do vrcholu se tedy floémem šírí látka
  stimulující kvetení, nazvaná florigen. Jak
  ukázaly roubovací pokusy, je florigen do znacné
  míry univerzální, stejný nebo podobný u ruzných
  druhu rostlin - dokonce i u druhu s rozdílnými
  fotoperiodickými reakcemi.

dlouhý den
z Hess 1983
6

• Florigen
• další príklad roubovacího pokusu

kvety N. sylvestris odstraneny po objevení
sem nejaký obrázek s roubováním
z Lang 1965
7

• Problémy s florigenem
• pro jeho existenci byly dlouho jen neprímé
  dukazy, nikdy nebyl biochemicky identifikován
  (napr. v extraktech z fotoperiodicky indukovaných
  listu). Možnosti vysvetlení byly dve
• florigen jako samostatná látka neexistuje,
  indukcní signál z listu je kombinace nekolika
  známých sloucenin (cukry, hormony apod.) - model
  propracovaný u Sinapis alba
• florigen je težko k nalezení, ale existuje a lze
  ho objevit s pomocí molekulární biologie

možné kvetní stimuly transportované z listu do
apexu, Corbesier a Coupland 2005
8

• Molekulárne-biologické metody pro výzkum
  fotoperiodizmu
• pro hledání zúcastnených genu jsou používány dva
  základní prístupy
• mutageneze a následné vyhledávání mutantu s
  narušenou fotoperiodickou citlivostí
• QTL analýza (QTL quantitative trait loci) Po
  zkrížení dvou odrud nebo ekotypu lze podle
  frekvence rekombinací v potomstvu približne
  lokalizovat na chromozómech lokusy, které se
  podílejí na kvantitativních znacích (jako
  kvantitativní znak lze chápat i dobu do kvetení).
  Následne je možno presnejšími technikami
  genetického mapování identifikovat konkrétní
  geny.
• Po nalezení alespon nekterých klícových genu lze
  využít další techniky molekulární biologie -
  studium genetické interakce mutací v ruzných
  genech, sledování hladin mRNA nebo proteinu za
  ruzných okolností (napr. na krátkém x dlouhém
  dni), vliv mutací nebo overexprese na genovou
  aktivitu, identifikace proteinových interakcí aj.
  Cílem je najít všechny zúcastnené geny, objasnit
  jejich vzájemné vztahy a nakonec popsat
  molekulární detaily celého procesu.

9

• Fotoperiodická kvetní indukce - hledání genu
• vyhledávání mutantu z mutantu se zmenenou dobou
  kvetení jsou nejlepšími kandidáty na roli ve
  fotoperiodické indukci takové, které mají výrazne
  sníženou citlivost na délku dne

vliv délky dne a vernalizace na pocet listu do
kvetení u mutantu Arabidopsis thaliana (Koornneef
et al. 1991)
10

• Fotoperiodická kvetní indukce - hledání genu
• QTL analýza duležitá hlavne u rýže, ale použita
  i u Arabidopsis a jiných druhu (napr. jecmen)

QTL analýza doby do kvetení u rýže, Yano et al.
1997
11
Merení casu ve fotoperiodických reakcích

• zjistilo se, že za merení délky dne/noci
  jednoznacne zodpovídá cirkadiánní oscilátor
• oscilátor prostrednictvím proteinu FKF1 a
  GIGANTEA (GI) reguluje transkripci genu CONSTANS
  (CO)
• protein CO predevším reguluje expresi genu
  FLOWERING LOCUS T (FT) protein FT indukuje
  procesy vedoucí k zakládání kvetu pod vzrostným
  vrcholem

model vztahu mezi cirkadiánním oscilátorem a
fotoperiodickou indukcí kvetení u Arabidopsis
thaliana,Hayama a Coupland 2004
12
Merení casu ve fotoperiodických reakcích

• jeden z klícových genu fotoperiodické dráhy u A.
  thaliana je CONSTANS (CO)
• pouze pri dlouhém dni je vysoká hladina CO mRNA
  na svetle

hladiny CONSTANS mRNA u Arabidopsis thaliana na
krátkém a dlouhém dni (Suárez-López et al. 2001)
13
Merení casu ve fotoperiodických reakcích

• mechanizmus u A. thaliana kombinace denního
  rytmu s prímým úcinkem svetla (tedy externí
  koincidence)
• denní rytmus hladina CO mRNA
• prímý úcinek svetla hlavne stabilizace
  vznikajícího proteinu CO behem odpoledne

model mechanizmu fotoperiodického merení casu u
Arabidopsis,Hayama a Coupland 2004
14
Merení casu ve fotoperiodických reakcích

• na denní prubeh hladin CO mRNA má vliv nejen
  cirkadiánní oscilátor, ale také prímé pusobení
  svetla
• príslušné molekulární interakce jsou dosti
  komplikované

regulace exprese genu COu Arabidopsis behem
dne,Imaizumi 2010
15

• Fotoperiodizmus mezidruhové srovnání
• jak se od sebe liší mechanizmy fotoperiodické
  regulace u ruzných druhu, predevším mezi
  krátkodenními a dlouhodenními rostlinami?
• Srovnání dlouhodenní Arabidopsis a krátkodenní
  rýže zúcastnené geny (CO, FT) jsou homologní,
  ale jiné jsou jejich vztahy. U Arabidopsis
  indukuje protein CO transkripci FT na svetle,
  zatímco u rýže CO inhibuje transkripci FT na
  svetle a indukuje ji za tmy. Ovšem na regulaci FT
  se u rýže zrejme podílejí ješte jiné geny! Pro
  objasnení je nutný další výzkum.

model mechanizmu fotoperiodického merení casu u
rýže, Hayama a Coupland 2004
16
Fotoperiodizmus mezidruhové srovnání

• Neco konzervováno, neco ne.
• Denní profily hladin mRNA u homo-logu CO a FT v
  prípade CO mRNA jsou dost podobné bez ohledu na
  druh rostliny a typ fotoperiodické reakce. Ale
  profily FT mRNA se výrazne liší mezi krátko- a
  dlouhodenními druhy.
• Merení délky dne evolucne konzer-vováno, ale
  jeho následné propojení na fotoperiodickou reakci
  ne? Možná, ale nutno porovnat víc druhu rostlin.

Song et al. 2010
17

• Florigen
• geny CO a FT jsou silne exprimovány v cévních
  svazcích listu - jejich funkce tedy muže být
  tesne spojena s regulací produkce florigenu v
  listech a/nebo s jeho šírením floémem
• Experiment s expresí CO a FT pod kontrolou
  tkánove specifických promotoru ukázal, že pro
  urychlení kvetení musí být CO exprimován ve
  floému, zatímco FT muže být exprimován v ruz-ných
  orgánech. Pohybuje se tedy produkt genu FT v
  rostline?

exprese genu CO a FT v semenáccích Arabidopsis
thaliana (reporterový konstrukt s GUS), Takada a
Goto 2003
18

• CO a FT blízko florigenu?
• Protein FT fyzicky interaguje s FD,
  transkripcním faktorem typu bZIP. Jejich komplex
  aktivuje transkripci genu pro identitu meristému,
  címž se indukuje tvorba kvetu.
• Gen FD je exprimován v apikální oblasti stonku,
  nikoli v listech. Další dukaz, že produkt genu FT
  se musí šírit rostlinou.

exprese genu FD v semenáccích Arabidopsis
thaliana (in situ hybridizace, reporterový
konstrukt s GUS, fúzní protein FD s GFP), Abe et
al. 2005
19

• protein FT jako florigen
• 2007 první jasné dukazy, že u Arabidopsis se
  protein FT šírí floémem do vzrostného vrcholu
• Zdálo se, že florigen je po 70 letech
  identifikován. Další potvrzení bylo ovšem žádoucí.

FT ve vzrostném vrcholu Arabidopsis thaliana
(rostliny s genovým konstruktem SUC2FTGFP
ft-7) nahore in situ hybridizace mRNA dole
fluorescence fúzního proteinu FT-GFP (Corbesier
et al. 2007)
20

• protein FT jako florigen
• Soucasne s objevy u Arabidopsis byla publikována
  práce, dokazující u rýže šírení proteinu Hd3a
  floémem do apexu. Hd3a je ortolog FT a urychluje
  kvetení rýže na krátkém dni.
• To potvrzuje univerzalitu florigenu je stejný
  nebo dosti podobný u ruzných rostlin, vcetne
  druhu s odlišnými fotoperiodickými reakcemi.
• Dukazy pro dálkové šírení proteinu FT byly
  silné, ale jen neprímé. Lze detekovat protein FT
  prímo ve floému?

Hd3a (ortolog FT) ve vzrostném vrcholu rýže
lokalizace fúzního proteinu Hd3a-GFP (Tamaki et
al. 2007)
21

• protein FT jako florigen
• Prímý dukaz šírení FT floémem u krátkodenního
  druhu tykve Cucurbita moschata jsou dva homology
  FT (Cmo-FTL1 a Cmo-FTL2) prítomny ve floémovém
  exudátu pri indukcní délce dne
• ve floémovém exudátu detekován jen protein,
  nikoli mRNA

izotopove znacené standardy peptidu
peptidy vzniklé štepením Cmo-FTL2
Hladiny proteinu Cmo-FTL2 ve floémovém exudátu
Cucurbita moschata na dlouhém a krátkém dni.
Pomocí LC-MS byly stanovovány peptidy specifické
pro Cmo-FTL2 (Lin et al. 2007)
22

• protein FT jako florigen (a nejen to!)
• Homology FT nalezeny u mnoha rostlin (obilniny,
  listnaté a jehlicnaté dreviny, vinná réva,
  merlíky, rajcata...).
• Krome kvetení FT patrne reguluje i jiné vývojové
  reakce, hlavne fotoperiodické. Napríklad u osiky
  zrejme kontroluje kvetení a rovnež nástup
  dormance pupenu, u smrku rašení a nástup dormance
  pupenu, u bramboru možná tvorbu hlíz.

vliv 19-h délky dne na rust letorostu a denní
profil hladin CO a FT mRNA u osiky (Böhlenius et
al. 2006)
23

• Evoluce fotoperiodických reakcí u rostlin
• homology nejduležitejších genu, hlavne CO, byly
  nalezeny u rady rostlin, vcetne mechu
• CONSTANS možná ovlivnuje i jiné fotoperiodické
  reakce než kvetení (napr. konstitutivní exprese
  CO z Arabidopsis potlacuje krátkodenní tuberizaci
  bramboru)
• i v rámci jednoho rodu se nezrídka vyskytují
  druhy s ruznými typy fotoperiodické reakce
  prechod mezi nimi by tedy mel být pomerne snadný
• Atraktivní je proto modulová hypotéza
  fotoperiodizmu. Predpokládá existenci evolucne
  konzervativního modulu pro merení délky dne/noci
  (s hlavní úlohou CONSTANS), který muže být spojen
  s ruznými moduly pro indukci fotoperiodických
  procesu (kvetení, tuberizace aj.). Typ
  fotoperiodické reakce závisí na zpusobu interakce
  techto modulu (viz ruzná regulace genu FT
  proteinem CO u Arabidopsis a rýže).
• pro další úvahy týkající se evoluce rostlinného
  fotoperiodizmu je nezbytné získat spolehlivá data
  o molekulárních mechanizmech u mnoha druhu