Presentazione di PowerPoint

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Richiami di Bioenergetica
2
Nei Sistemi Chimici abbiamo a che fare
colPotenziale Elettrochimico
Il Potenziale Elettrochimico è lEnergia
disponibile nelle Reazioni Chimiche per compiere
Lavoro
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Potenziale Elettrochimico
m
J/Mol
Unità Energia/Mole
DmoDGo/mol
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LEnergia in una Reazione
1 A 1 B 2C
In generale
Dm SNimprodotti SNimreagenti
Ni Rapporto Molare dei Reagenti
Per la nosra particolare reazione
Dm 2mC 1mA 1mB
5
AllEquilibrio
Dm 0
Energia del Sistema
Equilibrio
6
Per una Reazione che va verso lEquilibrio
Dm lt 0
Energia del Sistema
Dm
Dm
Equilibrio
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Il Potenzale Elettrochimico è la risultante di
diversi fattori
1) Composizione Molecolare
2) Concentrazione
3) Potenziale Elettrico
4) Pressione Osmotica,
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Energia dovuta alla Composizione Molecolare
mo

• Energia Conformazionale
• Energia Entropica contro Stabilità dei legami
• Solubilità-Interazione con il Solvente
• Coefficiente di Partizione
• Misurata in Condizioni Standard

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Condizioni Standard
Le Condizioni Standard sono le condizioni della
reazione appropriate per lesperimento con i
reagenti ad una concentrazione Molare

• Concentrazione 1 Molare
• In Acqua Pura
• pH7
• Pressione 1 atmosfera

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Energia di Concentrazione

• LEnergia del Gradiente di Concentrazione
• RT ln(C/Molare)

R Costante dei Gas (JoulesMole-1K-1) T
Temperatura (Kelvin, K)
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Energia del Potenziale Elettrico

• LEnergia dovuta alle cariche in un Campo
  Elettrico
• z F y

z Cariche (Moli di Carica/Mole) y
Potenziale Elettrico (Energia/Coulomb di Carica)
V J/C F Costante di Faraday 105
Coulomb/Mole di Carica
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Potenziale Elettrochimico
Conc Conco
m mo RT ln zFy
Conco è la Concentrazione in Condizioni Standard
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Cambiamento Conformazionale
(moB RT ln(B))-(moA RT ln(A))
(moB RT ln(B))-(moA RT ln(A)) 0
-RT ln (B) RT ln (A) moB moA Dmo
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Cambiamento Conformazionale
AllEquilibrio
(moB RT ln(B))-(moA RT ln(A)) 0
Dmo
-RT ln (B) RT ln (A)
-RT ln (B/A)
Risolvendo rispetto a
B/A
Keq
exp (-Dmo/RT)
Distribuzione di Boltzmann
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Modello di Gating del Canale
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Voltaggio-dipendenza del gating
Le posizioni ? e ? corrispondono a due minimi nel
profilo energetico e vi è una singola barriera
energetica tra di esse. In una popolazione di N
canali simili, n1 avranno la loro particella di
gating in posizione ? e n2 in posizione ?,
cosicchè n1n2N.
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Equazione di Boltzmann della meccanica
statistica Mette in relazione le probabilità di
una particella di trovarsi nello stato ? o nello
stato ? con le differenze di energia u2-u1Du dei
due stati
La particella spende il minor tempo nello stato
ad energia maggiore
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1o caso il campo elettrico transmembrana è zero
In assenza di campo elettrico (E0) la
distribuzione di Boltzmann dellenergia della
popolazione di molecole sarà

Dove n1 il no di particelle con energia u1 in
posizione (1) (canale chiuso) n2 il no di
particelle con energia u2 in posizione (2)
(canale aperto), u2-u1 è la variazione di energia
libera (DG) relativa al cambio conformazionale da
1 a 2
Quindi, in assenza di un campo elettrico la
differenza di energia conformazionale (u2-u1) tra
le posizioni 1 e 2 corrisponde al lavoro chimico
(w) per muovere ciascuna particella di gating da
1 a 2.
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2o caso il campo elettrico transmembrana è ? da
zero
Se esiste un campo elettrico (E?0) la componente
energetica posseduta dalla particella in quanto
elettricamente carica sarà -zeV z ? no di
cariche in ciascuna particella di gating e ?
carica elementare dellelettrone (4.810-10
ues1.610-10 coulomb V ? potenziale
elettrico Quindi, includendo la componente di
energia (lavoro) elettrica, avremo
Se nel nostro sistema il canale è aperto quando
la particella di gating è in (2) e chiuso quando
è in (1), la frazione di canali aperti è anche
uguale alla frazione di particelle in (2)
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Ritorniamo allequazione
Ponendo si ottiene
dove V1/2 è il voltaggio V al quale metà dei
canali sono aperti (Po0.5).
Lequazione di Boltzmann dà una curva sigmoide in
un grafico lineare di Po in funzione di V. Quanto
più elevata è z tanto maggiore è la pendenza
della curva
Notare che quanto più è elevata la carica z,
tanto maggiore è la pendenza della curva
Ricordiamo che w corrisponde al lavoro per
muovere ciascuna particella di gating dalla
posizione 1 alla 2 ovvero, la differenza di
energia tra le due posizioni in assenza di un
potenziale di membrana.
21
Z4.8 (Na)
Z3.9 (K)
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Che significato ha il valore di z?

1. Semplicemente potrebbe essere la quantità di
   carica mossa da un lato allaltro della membrana
   durante il processo di gating.
2. Potrebbero però esistere più particelle di gating
   per canale.

Per esempio con quattro particelle che si muovono
indipendentemente, il valore di z ottenuto
applicando la precedente equazione si riferirebbe
a ciascuna singola particella e la carica di
gating per lintero canale sarebbe 4z.
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Alcune definizioni..
DmoDGo/mol
F/RTeo/kT
R8.3143 jouleK-1mol-1 k1.3805410-23
jouleK-1 RNAk (6.02221023 mol-11.3805410-23
jouleK-1) NANumero di Avogadro n. di molecole
contenute in una mole (6.02221023mol-1) F96490
Cmol-1 VstatVolt (299.8 volt)erg/ues10-7
joule/0.333 10-9 C eo carica elementare
dellelettrone (0.16022 10-18 C)
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A 0 mV Lattività del canale è caratterizzata
dalla relativa stabilità dello Stato Attivato
rispetto a quello chiuso e non dipende dalla
posizione delle cariche rispetto al campo
elettrico, dal momento che non cè un gradiente
di potenziale elettrico.
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Energia
EM Nessun Effetto
EM Nessun Effetto
C
Bagno
m (Gate) zG F 0 mV 0
Membrana
A
m (Gate) zG F 0 mV 0
Distribuzione di Boltzmann Basata solo su Dmo
Citoplasma
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A -70 mV Lattività del canale è caratterizzata
dalla relativa stabilità dello Stato Chiuso e
dipende dalla posizione delle cariche rispetto al
campo elettrico, dal momento che cè un gradiente
di potenziale elettrico.
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Energia
EM Stabilizzante
EM Destabilizzante
C
Bagno
m (Gate) zG F 0 mV 0
Membrana
A
m (Gate) zG F -70 mV lt 0
La distribuzione di Boltzmann shifta verso lo
stato C
Citoplasma
28
a 40 mV Lattività del canale è caratterizzata
dalla relativa stabilità dello Stato Attivato e
dipende dalla posizione delle cariche rispetto al
campo elettrico, dal momento che cè un gradiente
di potenziale elettrico.
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Energia
EM Stabilizzante
EM Destabilizzante
C
Bagno
m (Gate) zG F 0 mV 0
Membrana
A
m (Gate) zG F 40 mV gt 0
La distribuzione di Boltzmann shifta verso lo
Stato A
Citoplasma
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Il gating dei canali voltaggio-dipendenti
ovvero
Come fa il voltaggio ad aprire i canali?
Il controllo dellattività dei canali per mezzo
del voltaggio è la chiave che sta alla base
delleccitabilità neuronale e del signalling
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Canali ionici voltaggio-dipendenti Famiglia di
canali a 6 domini transmembrana (TM)
Questa è una delle 4 (pseudo)subunità
H5
Il poro è delineato da 4 subunità o
pseudosubunità Ciascuna contiene 6 segmenti TM
(S1-S6) e una regione H5 (loop P)
I canali ionici voltaggio-dipendenti contengono
sensori del voltaggio intrinseci
Il segmento S4 corrisponde al sensore del
voltaggio
Vi appartengono Canali voltaggio-dipendenti del
Na, Ca2 e K Canali del K Ca2-attivati Canali
cationici attivati dalliperpolarizzazione, ecc.
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X 4
33
Attiva la spirale
Nel canale del K Shaker, ciascun segmento S4
contiene 7 residui basici regolarmente
distribuiti ogni 3 aa. Canale chiuso la 2a Arg
di S4 è seppellita nel bilayer Canale aperto la
2a Arg fuoriesce dal lato extracell., mentre il
4o e 5o residui basici si muovono dal citosol
allinterno del bilayer
34
Il movimento del sensore del voltaggio, facendo
aprire il canale, produce una corrente ionica
50 mV
-100 mV
Corrente Ionica
1000 pA
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Il movimento del sensore del voltaggio produce
anche una corrente di gating
50 mV
-100 mV
Corrente Ionica
1000 pA
come è possibile smascherare la corrente di
gating?
Corr. di Gating
Soluzione senza K
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Il movimento del sensore del voltaggio produce
una corrente di gating
50 mV
-100 mV
Ig dqg/dt ? qg ?Igdt
10 pA
Corr. di Gating
1 ms
Soluzione senza K
Carica totale di gating
cariche elementari /canale
Numero dei canali
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Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica
1
2
3
4
5
6
7
IL
R
VI
R
LV
R
VF
R
IF
K
LS
R
HS
K
GL
4
R
??
K
2
R
??
neutral AA
?
q/n
0
-
(e
charges)
-2
-4
Klisina
Rarginina
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Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica
1
2
3
4
5
6
7
IL
R
VI
R
LV
R
VF
R
IF
K
LS
R
HS
K
GL
4
R
??
K
2
R
??
neutral AA
?
q/n
0
-
(e
charges)
-2
-4
39

• Nel canale del K Shaker la presenza di 4
  segmenti S4 che fungono da sensori del voltaggio
  intrinseci spiega la ripida dipendenza
  dellattivazione del canale dal voltaggio.
• Le 4 subunità identiche si muovono verso il lato
  extracellulare in due fasi distinte
• Prima indipendentemente luna dallaltra
• Poi in maniera cooperativa, portando allapertura.

40
(No Transcript)
41
MacKinnon_Nature01473.pdf MacKinnon_Nature01580.pd
f MacKinnon_Nature01581.pdf
42
Struttura del Canale K Voltaggio-Dipendente KvAP
da Aeropyrum pernix
La visione del tetramero del canale K è dal lato
intracellulare. Ciascuna subunità è colorata
separatamente e contiene 6 a-eliche (etichettate
S1-S6 alle loro estremità N-terminali nella
subunità blu). Le eliche S5-S6 formano il poro e
il filtro di selettività per il K. Le eliche S4
formano i sensori del voltaggio. Gli ioni K sono
colorati in verde.
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Struttura del Canale K Voltaggio-Dipendente KvAP
da Aeropyrum pernix
Visione laterale. È indicato lo spessore della
membrana (40 A)
44
Conformazioni del Sensore del Voltaggio
Vista Laterale Le linee orizzontali demarcano
approssimativamente i contorni della membrana. Si
intravvedono 6 ioni K K1-K4 sono nel filtro di
selettività. I residui 196-199 comprendono il
filtro di selettività e ne è mostrata lossatura
in bianco. I gruppi CO della catena principale
di tali residui formano legami di coordinazione
con gli ioni K.
Chiuso Vr-100 mV
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Conformazioni del Sensore del Voltaggio
Vista Laterale Le linee orizzontali demarcano
approssimativamente i contorni della membrana. Si
intravvedono 6 ioni K K1-K4 sono nel filtro di
selettività. I residui 196-199 comprendono il
filtro di selettività e ne è mostrata lossatura
in bianco. I gruppi CO della catena principale
di tali residui formano legami di coordinazione
con gli ioni K.
Aperto depolarizz.
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Lo stato chiuso prevale al potenziale di riposo
della cellula ( -100 mV). Lo stato aperto è
favorito da una depolarizzazione della
membrana. In questo modello, S2 è assunto
rimanere inalterato durante lo switch S3a e S3b
subiscono dei riarrangiamenti sostanziali si
ipotizza che anche la connessione tra S4-S5 sia
rimodellata.
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Ingrandimento del Sensore del Voltaggio
Una Subunità, Chiusa Delle eliche S2-S4 è
mostrata lossatura. Le arginine che conferiscono
la sensibilità al voltaggio, sono mostrate come
bastoncini colorati. Sono mostrati anche
lossatura del filtro di selettività e gli ioni
K.
chiuso
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Ingrandimento del Sensore del Voltaggio
In aggiunta al movimento della paletta sensore
del voltaggio", notare nello stato aperto la
formazione di un ponte salino (legame ionico) tra
lAsp 80 e lArg 133.
aperto
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Accessibilità dei Residui
Nella conformazione chiusa, i residui evidenziati
in magenta sono esposti allo spazio interno.
Interno
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Accessibilità dei Residui
Nella conformazione aperta, i residui evidenziati
in rosso sono vicini allo spazio esterno (10 Å) o
si estendono verso di esso.
Esterno
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La struttura del canale del K KvAP è descritta
inA. Jiang Y, Lee A, Chen J, Ruta V, Cadene M,
Chait BT, MacKinnon, R. (2003) "X-Ray Structure
of a Voltage-Dependent K Channel". Nature 423
33 I movimenti delle palette del voltaggio sono
descritti inB. Jiang Y, Ruta V, Chen J, Lee A,
MacKinnon, R. (2003) "The principle of gating
charge movement in a voltage-dependent K
Channel". Nature 423 42 1ORQ.pdb 1ORS.pdb
52
FINE