Genotoxicit

1
Genotoxicitás

• Genotoxicitási tesztek
• Bakteriális reverz mutáció teszt
• In vitro mikronukleusz teszt

2
A genotoxicitás szintjei Kromoszóma típusú
mutációk (szerkezeti, számbeli változás) Pontmutá
ciók
egy vagy néhány bázis -
cseréje - kiesése - beékelodése
silent, missense, nonsense
frame-shift, leolvasási keret eltolódása
A genotípus megváltozása nem mindig vezet a
funkció (fenotípus) megváltozásához
(silentcsendes mutációk, mutáció nem kódoló
régióban) A mutáció lehet káros, semleges,
elonyös
3
Mutagén Karcinogén

• a mutagén fizikai vagy kémiai ágens, mely
  növeli a mutációk képzodésének gyakoriságát
• indukált mutáció a mutagének által okozott
  változások a genetikai állományban
• a halálozások oka a civilizált világban 40-ban
  rákos daganat
• - a rákos megbetegedések közel 90-át a
  környezetünket szennyezo mutagének okozzák
• - a mutagén vegyületek nagy része rákkelto
  (karcinogén) is !!!!!!!!!!!!
• - évente néhány ezer olyan vegyületet állítanak
  elo, amelyek korábban nem léteztek a Földön
  (gyógyszer alapanyagok, növény- vagy faanyagvédo
  szerek, élelmiszer-adalék, kozmetikum, háztartási
  vegyszer stb.)
• a mutagének és a karcinogének közötti szoros
  kapcsolat szükségessé teszi a környezetünkben
  lévo mutagén vegyületek kimutatását

4
Spontán mutációk

• okai
• a bázisok alternatív formái (keto/enol,
  amino/imino tautomerizáció)
• a replikáció során a szálak elcsúszása
  következtében kisméretu inszerciók és deléciók
  keletkezése
• - a DNS szerkezeti változásai (depurináció és
  deamináció, amelyek a bázisok párosodási
  tulajdonságait változtatják meg)

5
Tautomerizáció
Normál bázispárosodás (keto és amino formák)
A guanin enol formája timinnel, az adenin imino
formája pedig citozinnal képes H-híd
kialakítására.
A citozin imino formája adeninnel, a timin enol
formája pedig guaninnel képes H-híd
kialakítására.
A párosodási hiba a replikáció során az újonnan
szintetizált szálban megmarad és állandósul
6

• Indukált mutációk
• külso okokból származó mutációk
• vegyszerek számos módon okozhatnak mutációkat
• bázis analógok a DNS-be beépülnek, de nem a
  megfelelo bázissal párosodnak
• alkiláló, deamináló szerek, oxidáló anyagok a
  DNS bázisok szerkezetét és párosodási
  tulajdonságait megváltoztatják
• interkaláló szerek a bázisok közé ékelodnek és
  nukleotid inszerciót vagy deléciót okoznak

7
Bázis analógok
a természetes bázisokhoz hasonló szerkezetuek, a
DNS polimeráz a kettos spirálba beépíti
pl. 5-brómuracil (5BU) timin analóg adeninnel és
guaninnal is (!) képes párosodni tranziciót okoz
T-Agt5BU-Agt5BU-GgtC-G C-Ggt5BU-Ggt5BU-AgtT-A 2-amin
opurin (2AP) adenin analóg a timinen kívül
citozinnal is (!) képes párosodni tranziciót
okoz T-AgtT-2APgtC-2APgtC-G C-GgtC-2APgtT-2APgtT-A
8
Alkiláló szerek
alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a
nukleinsavak bázisaira és azokat módosítják
pl. etil-metánszulfonát (EMS) foként a guanint,
kisebb mértékben a timint módosítja a
6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-GgtT-A
tranzíciót eredményez a 4-etil-timin a guaninnal
párosodik, és így T-AgtC-G tranzíció jön létre
9
Deamináló szerek a spontán deamináción kívül
különbözo vegyszerek is képesek a bázisok amin
csoportjait támadni
pl. salétromossav a citozint, az adenint és a
guanint támadja citozin uracil, mely a
következo replikáció során adeninnel párosodik és
C-G gt T-A tranziciót okoz adenin
hipoxantin, ami citozinnal párosodva T-A gt C-G
tranziciót eredményez guanin xantin, ez
elsosorban citozinnal, de kisebb mértékben
timinnel is párosodva C-G gt T-A tranziciót hoz
létre hidroxilamin a citozin amino csoportját
támadja, és hidroxilaminocitozin keletkezését
okozza a hidroxilaminocitozin adeninnel
párosodik, és C-G gt T-A tranziciót okoz
10
Interkaláló vegyületek
- általában gyurus vegyületek, melyek
térkitöltése a bázispárokhoz hasonlít - a DNS
kettos spirálban egymás melletti bázispár közé
képesek beépülni - a beépülés a kettos spirál
alakját torzítja, ami azután a replikáció során
egy nukleotid kiesését vagy beépülést
okozza pl. proflavin akridin sárga etidium-bromid
dioxin
11
A genotoxicitás mérése

• többféle, nemzetközileg elfogadott tesztrendszer
• bakteriális tesztek (Salmonella typhimurium,
  Esherichia coli)
• eukarióta egysejtuek (pl. Saccharomyces
  cerevisiae, Aspergillus nidulans)
• élesztogomba penészgomba
• rovarok (ecetmuslica Drosophila melanogaster)
• gerincessejt-vonalak (humán és egyéb emlos
  sejtvonalak)
• növények (lóbab, árpa, vöröshagyma)
• in vivo (egér, hörcsög, patkány)

12
Alternatív ( in vitro) genotoxicitási tesztek

• állatkísérletek számának csökkentése
• gyors (short term study)
• - költséghatékony
• Végpontok
• pontmutáció
• DNS törés
• repair (DNS szintézis NEM az S fázisban)
• kromoszóma aberrációk

13
Mutációk detektálása

• - a fajok nemzedékrol nemzedékre mutatott
  állandósága arra utal, hogy a mutációk
  bekövetkezése ritka esemény
• a valóságban azonban a megfigyelhetonél jóval
  több mutáció keletkezik
• körülbelül 1,000,000,000,000,000,000 (1018) DNS
  sérülés minden felnott emberben naponta!
• kb. 30.000.000.000 (3x1010) sejtünk van . . .
  (3x107/nap/sejt)
• mivel leggyakoribbak a recesszív mutációk, a
  legtöbb új mutáció észlelését a dominancia
  megakadályozza
• az új mutációk észlelése ezért a legegyszerubb a
  haploid szervezetekben
• diploidokban a mutációk kimutatására speciális
  rendszerek szükségesek
• - a mutációk gyakorisága alacsony, ezért
  mutánsokat nagy egyedszámú populációból lehet
  kimutatni

14

• Bakteriális reverz mutagenitási teszt
• Kidolgozója, Bruce Ames után AMES teszt
• Validált (OECD Guideline 471)
• Pontmutációk észlelésére alkalmas
• Több humán genetikai betegség pontmutációkra
  vezetheto vissza.
• Baktérium törzsek auxotróf mutánsok
• Salmonella typhimurium his- hisztidint és
  biotint igényel
• Escherichia coli trp- triptofánt igényel

• - nem képesek minimál táptalajon növekedni
• megnövelt mutációs érzékenység
• megnövekedett sejtfal átereszto képesség
• DNS hibajavító rendszer kiküszöbölése
• metabolikus aktiválás kell S9 frakció
• patkány májából készült enzimkivonat
• a baktériumok nem rendelkeznek oxidatív
  metabolizáló enzimrendszerrel

Nagy populációban bekövetkezo ritka mutációs
esemény detektálására alkalmas
15
A baktériumok által képzett telepek
Salmonella
E. coli
16
Salmonella typhimurium his- mutánsainak
reverzióját figyelik a tesztelendo vegyületek
hatására
Reverzió back mutáció
his Hisztidint szintetizál Hisztidinmentes
tápközegben életképes
his- Hisztidin bioszintézisére képtelen Csak
hisztidint tartalmazó tápközegben életképes
Escherichia coli trp- mutánsainak
reverzióját figyelik a tesztelendo vegyületek
hatására
17

• A teszttörzsek jellegzetességei
• Különbözo típusú his mutációkat tartalmaznak,
  ezért a mutáció reverziója történhet
• bázispár szubsztitúcióval
• frame-shift segítségével
• különbözo hatásmechanizmusú mutagén vegyületek
  mutathatók ki, azaz információt nyújt a
• genotoxikus anyagok által eloidézett mutációk
  típusáról

18
A kísérlet kivitelezése
19
A kísérlet kivitelezése
S9 patkány májából készült enzimkivonat S9-et
adagolva modellezni lehet az emlosökben lezajló
enzimatikus reakciókat, így a bakteriális
géntoxikológiai tesztekbol következtethetünk a
szennyezoanyagok magasabb rendu szervezetekre
gyakorolt hatására
20
Pozitív kontroll ellenorzése
21
Az eredmények értékelése

• A kísérleti anyag mutagénnek tekintheto, ha
• A kísérleti anyaggal kezelt lemezek
  revertánsszámai a kontroll lemezek
  revertánsszámaihoz képest koncentrációfüggo
  növekedést mutatnak
• A revertánsszámok reprodukálható, biológiailag
  jelentos növekedést mutatnak legalább egy
  koncentrációcsoportban, legalább egy
  baktériumtörzsnél metabolius aktiváló rendszer
  hozzáadásával vagy anélkül
• Törzsek TA 1535, TA100, TA98, TA 1537 és TA 102
  vagy E. coli WP2uvrA
• Biológiailag jelentos törzsenként változik
  (2-szeres, 3-szoros)
• Statisztikai értékelés nem szükséges

22
Továbbfejlesztett Ames teszt (Ames II) 96 lukú
mikrotitráló lemezen 6 törzzsel (TAMix) végezheto
egyszerre pH indikátor festék a tápközegben
(brómkrezol lila) A hisztidinmentes tápközegben
szaporodó (revertált) baktériumok savasítják a
tápközeget
Lila nem mutáns Sárga back-mutáns
23
In vitro mikronukleusz teszt Validált (OECD
Guideline 487) Kromoszóma mutációk kimutatására
alkalmas Kb 80 egyezés a kromoszóma aberráció
teszttel, érzékenyebb, olcsóbb,
gyorsabb Mikronukleusz a sejtmagnál kisebb
méretu, membránhatárolt DNS darabok, amelyek a
citoplazmában jelennek meg a sejtosztódás zavara
esetén
24
In vitro mikronukleusz teszt Citotoxikus
ágensre adott sejtválasz
25
In vitro mikronukleusz teszt Citotoxikus
ágensre adott sejtválasz
26
In vitro mikronukleusz teszt - acentrikus
kromoszóma fragment klasztogén anyag -
centromérral rendelkezo fragment aneugén
anyag
(a) a mikronukleusz acentrikus kromoszóma
fragmensbol származik (b) a mikronukleusz egész
kromoszómát tartalmaz
A klasztogén anyagok törést okoznak a DNS-ben,
így az osztódás során kromoszóma fragmentek
veszhetnek el, vagyis mikronukleusz képzodhet
belolük. Az aneugén anyagok olyan változást
okoznak a sejtosztódásnál, ami aneuploidiához
vezet. Az aneuploidia a normális diploid
kromoszómaszámtól való eltérés, vagyis például
egy teljes kromoszóma elvesztése, avagy
mikronukleusszá való alakulása.
27
A mikronukleusz képzodés módjai
28
A mikronukleusz képzodés módjai
29
A mikronukleusz képzodés módjai A genetikai
anyag a sejtmembrán felé áramlik. Ezek szerint a
mutagén anyaggal való expoziót követoen eloször a
sejtmag alakja változik meg, bimbózni kezd, majd
a sejtmagból kizárt DNS darabkák mikronukleusz
formát öltenek, és ezt követoen még a sejtbol is
kizáródhatnak mini sejt formájában.
A exponált sejt B metafázis C poliploid
metafázis D poliploid sejtmag E szabálytalan
sejtmag F bimbózó sejtmag G szabálytalan
sejtmag és mikronukleusz H szabálytalan sejtmag
és mini sejt
30
In vitro mikronukleusz teszt A kísérlet
kivitelezése sejtek felszaporítása kísérleti
anyag koncentráció sorával való kezelés,
kontrollok rátenyésztés citokelazinB
hozzáadásával a tenyésztés terminálása kicseppent
és, festés, fedés
A kísérlet értékelése mikronukleált binukleáris
sejtek összes sejthez való viszonyítása morfológi
ai kritériumok MNltsejtmag/3 jól szeparált,
nem bimbózó azonos festodési intenzitás a
sejtmaggal