Diapositive 1

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Etude de la variabilité du potentiel protéolytique
de paroi chez Streptococcus thermophilus Caractér
isation de la variabilité du gène prtS
Sous la direction Pr. Annie DARY et Dr. Clarisse
PERRIN
Wessam GALIA Ecole Doctorale RP2E 15 janvier 2009
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• Production de peptides bioactifs

• Le peptide bioactif dorigine alimentaire
• ne répond pas seulement aux besoins nutritionnels
  
• joue un rôle bénéfique chez le consommateur
• rôle anxiolytique ou anti hypertensif...

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• Production de peptides bioactifs issus du lait

• Les protéines du lait renferment dans leur
  séquence une grande variété de peptides
  potentiellement bioactifs
• par protéolyse in vitro
• ajout à laliment
• directement dans lorganisme
• générés par des protéases endogènes
• 2 des gènes humains codent pour des protéases
  ou des inhibiteurs de protéases
• pendant la fabrication / transformation de
  laliment (fermentation, affinage)
• générés par des bactéries lactiques
  (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus ..)

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• Production de peptides bioactifs par voie
  microbienne
• Mieux comprendre le potentiel protéolytique dune
  bactérie lactique Streptococcus thermophilus
• Caractérisation du potentiel protéolytique
• Caractériser les différents acteurs du système
• Caractériser sa variabilité au sein de lespèce
  St. thermophilus
• dans le but de sélectionner des souches capables
  de libérer des peptides bioactifs.

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• Présentation de
• Streptococcus thermophilus

• Une des bactéries lactiques les plus utilisées
  dans lindustrie des ferments (du lait)
• Homofermentaire et se développe entre 37 et 42C
• Appartient au genre Streptococcus
• Non pathogène
• Séquençage complet de 3 génomes a révélé
• - labsence des gènes de virulence
• - une faible variabilité de séquence

Bolotin et al., Nature Biotechnology (2004)
221554-1558
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• Variabilité phénotypique chez St. thermophilus

Variabilité phénotypique affecte différents
caractères tels que - morphologie des
colonies, - taille des chaînettes, - résistance
à différents stress, - vitesse de croissance et
dacidification du lait
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• Système protéolytique de St. thermophilus

Milieu extracellulaire
Paroi bactérienne
Cytoplasme
Monnet, Bull. Soc. Fr. Microbiol (2006) 2123-28
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• Les protéases extracellulaires
• chez les bactéries lactiques

Cell Wall Membrane Cytoplasme
CW M C
Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol
71 394406
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• Les protéases extracellulaires
• chez les bactéries lactiques

Cell Wall Membrane Cytoplasme
CW M C
W
W
W
W
W
Espaceur
Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol
71 394406
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• Les protéases extracellulaires
• chez les bactéries lactiques

Cell Wall Membrane Cytoplasme
CW M C
Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol
71 394406
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• Caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385

• Protéase de 169 kDa et de 153 kDa après
  maturation
• Appartient à la famille des protéases à sérine,
  famille des subtilisines
• Capable dhydrolyser les caséines ?S1 et ?
• Gène de 4755 pb, exprimé en conditions de
  carence azotée
• Régulation du gène prtS est inconnue
• Fernandez-Espla et al., AEM (2000)

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• Caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385

• Protéase de 169 kDa et de 153 kDa après
  maturation
• Appartient à la famille des protéases à sérine,
  famille des subtilisines
• Capable dhydrolyser les caséines ?S1 et ?
• Gène de 4755 pb, exprimé en conditions de
  carence azotée
• Régulation du gène prtS est inconnue
• Fernandez-Espla et al., AEM (2000)

• Activité protéolytique de surface retrouvée
  uniquement chez quelques souches
• Shahbal et al., AEM (1993)

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• Démarche expérimentale

• Evaluer la variabilité génétique dune
  collection de souches de St. thermophilus

• Evaluer la variabilité du potentiel
  protéolytique de surface de St. thermophilus

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• Génotypage de souches de St. thermophilus
• Séquençage de la région Internal Transcribed
  Spacer 16S-23S

(Galia et al., 2009)
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• Génotypage de souches de St. thermophilus

Mise en évidence dune variabilité génétique au
sein de la collection de souches de St.
thermophilus
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• Variabilité du système protéolytique de surface

Détermination de lacidité Dornic (acide lactique
produit) permet dévaluer la croissance dune
souche en milieu lait
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Variabilité du système protéolytique de surface
après 6 h de croissance en lait ( Dornic)
12 Souches à fort pouvoir acidifiant 53,4
4,5D
2 Souches à faible pouvoir acidifiant 11,0
2,4D
16 Souches à moyen pouvoir acidifiant 29,8
4,2D
Variabilité du système protéolytique de surface ?
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• Variabilité du système protéolytique de surface

• Recherche du gène prtS

800 pb
Souches à fort pouvoir acidifiant
12/12 souches posséderaient le gène prtS
Souches à faible pouvoir acidifiant
2/2 souches ne possèdent pas le gène prtS
Souches à moyen pouvoir acidifiant
11/16 souches posséderaient le gène prtS
5/16 souches ne possèdent pas le gène prtS
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• Variabilité du système protéolytique de surface

• Recherche de lactivité de la protéase PrtS par
  zymographie

PB18o
PrtS
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• Variabilité du système protéolytique de surface

• Recherche de lactivité de la protéase PrtS par
  zymographie pour toutes les souches

PrtS
Pouvoir acidifiant Nombre de souches Faible 2 Moyen 5 Moyen 8 Moyen 3 Fort 12
Présence du gène prtS - -
Activité protéolytique - - -
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Variabilité de lactivité protéolytique de
surface

• Pourquoi ?
• Gène prtS muté
• Gène prtS non exprimé
• Séquençage du gène prtS chez
• 4 souches à moyen pouvoir acidifiant (prtS
  PrtS-)
• 3 souches à fort pouvoir acidifiant (prtS PrtS)
• Comparaison de séquences
• 100 identiques entre elles et avec la souche
  LMD-9
• 95 identiques avec la souche CNRZ385

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• Variabilité du système protéolytique de surface

Séquençage du gène prtS

• SS PP
  PR A H W
  AN
• PB18o ou LMD9 1 36 177 492
  1110 1477 1583
  1618
• CNRZ 385 1 36 145 460
  1077 1444 1550
  1585

PB18o Moyen pouvoir acidifiant LMD9 Fort pouvoir
acidifiant
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• Variabilité du système protéolytique de surface

Séquençage du gène prtS
Région fixation du substrat
PB18o ou LMD9 936SGNKNFYSGDP946 CNRZ 385
904SGDKNIYSGNP914
PB18o Moyen pouvoir acidifiant LMD9 Fort pouvoir
acidifiant
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• Conclusion

Variabilité du système protéolytique de surface
- Variabilité en terme de présence / absence du
gène prtS
- 2 allèles prts différents ont été mis en
évidence chez S. thermophilus
Variabilité affecte la régulation du gène
Pouvoir acidifiant Gène prtS Activité caséinolytique
Fortes 12/12 12
Moyennes 11/16 3/16
Faibles 0/2 0/2
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Perspectives
- Etude de la régulation du gène prtS entre -
les souches qui ont le gène et qui lexpriment
fortement - et les souches qui ont le gène et
qui lexpriment peu ou pas.