El

1
Elétroforese 2D e análise de Proteomas
2
Proteômica
3
Alguns objetivos da análise de Proteomas

• Separar, identificar e catalogar todas as
  proteínas existente na amostra biológica
  analisada.
• Identificar diferenças protéicas específicas que
  diferem duas ou mais condições que estão sendo
  comparadas.

4
Análise Proteômica é dirigida por dois
processos separação de proteínas e análise
espectral de massa.
Método de separação de proteínas
Eletroforese bi-dimensional Mw e pI
Cromatografia líquida (HPLC)
Análise espectral de massa (Espectrometria de
massa)
Determinação de massa de peptídeos obtidos por
proteólise limitada
Determinação estrutural Sequência de aminoácidos
Determinação de massa de proteína intacta
5
Fluxo da informação gênica
Diversidade de funções
6
Eletroforese bidimensional (2D)
7
Características da eletroforese bidimensional

• 1. Combinada com a identificação por MS, é uma
  das principais técnicas utilizadas em estudos
  proteômicos,
• 2. Possibilita a separação de misturas complexas
  de proteínas de acordo com seu pI, volume (massa)
  molecular, solubilidade e abundância relativa,
• 3. Pode separar alguns milhares de proteínas
  simultaneamente dependendo do tamanho do gel, da
  concentração de acrilamida e bis- acrilamida e da
  faixa de pH,
• 4. Produz um mapa de proteínas que reflete
  alterações nos níveis de expressão, presença de
  isoformas e de modificações pós-traducionais
• 5. Permite análises estruturais por MALDI, ESI
  MS/MS ou seqüenciamento de Edman

8
Conceitos básicos- eletroforese

• Refere-se a migração de moléculas carregadas sob
  a ação de um campo elétrico,
• Trabalho pioneiro de Arne Tiselius (1937).
• Prêmio Nobel de 1948,
• Normalmente utiliza-se a poliacrilamida como
  suporte para o estudo de proteínas.

9
Eletroforese 2D
IEF A carga das proteínas depende do pH do meio
10
Surgimento da eletroforese 2D

• Década de 1970 cada - surge a 2D-PAGE
• Trabalhos de MacGillivray et al.( 1974)
• OFarrel (1975) Klose (1975).

OFarrel
11
Características da eletroforese 2D
12
Esquema básico da elétroforese 2D
13
Principais componentes moleculares da bactéria
E. coli
14
ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
Eletroforese 2D de proteínas totais (proteoma) de
células de Escherichia coli

• análise simultânea de até 5.000 proteínas

• permite comparação de todas as proteínas
  expressas por uma célula em dois momentos
  diferentes
• análise do efeito de hormônios,
• análise do efeito de drogas
• estados fisiológicos (desenvolvimento)
• condições patológicas diversas (vírus,
• bactérias,etc.)

15
Proteoma Comparativo ou Diferencial
condição
condição
Sobreposição permite identificar diferenças nos
padrões de bandas
16
Eletroforese 2D

• As etapas básicas
• 1- Preparação das amostras,
• 2- Focalização Isoelétrica (IEF),
• 3- Eletroforese desnaturante em gel de
  poliacrilamida (SDS-PAGE),
• 4- Detecção das amostras no gel,
• 5- Digitalização e análise de imagem,

Um grande passo no uso da eletroforese 2D ocorreu
com o progresso nas técnicas analíticas de
identificação de proteínas
17
1. Preparação da Amostra
Obtenção das proteínas

• Para a focalização isoelétrica, as proteínas
  devem ser completamente solubilizadas,
  desagregadas, desnaturadas e reduzidas,
• Os métodos de lise celular dependerão todos da
  natureza da amostra (osmótica, enzimática, com
  detergentes, sonicação, moagem, etc.)

18
O processo de solubilização
1. Preparação da Amostra

• Deve atingir os seguintes objetivos
• Quebrar interações macromoleculares incluindo
  todas as interações não covalentes e as pontes
  dissulfeto,
• Prevenir modificações nas proteínas,
• Manter as proteínas em solução durante a 2-DE.

19
Hierarquia da estrutura de proteínas
Primária - Sequência de aminoácidos Secundária
diferentes regiões da sequência formam estruturas
regulares como as hélices ? e as fitas
? Terciária formadas pelo empacotamento das
estruturas secundárias produzindo
domínios Quaternária formada pela combinação de
cadeias polipeptídicas
Lehninger Principles of Biochemistry 3a. Ed.
20
Quais são os tipos de forças que mantém a
estrutura tridimensional de uma proteína ?

• Pontes de H
• Aminoácidos polares
• Ligações iônicas
• Aminoácidos carregados
• Interações hidrofóbicas
• Aminoácidos apolares
• Forças de Van der Waals
• Qualquer aminoácido

21
1. Preparação da Amostra
Solubilização da Amostra

• Tampões de amostra normalmente possuem
• Agentes caotrópicos (Uréia e/ou tiouréia),
• Detergente não Iônico ou zwitteriônico (CHAPS,
  Triton),
• Agente redutor,
• Anfólitos,
• Inibidores de proteases

22
1. Preparação das amostras
Rompimento de interações não covalentes

• Agentes caotrópicos
• Uso de reagentes caotrópicos, como, a uréia, por
  alterarem os parâmetros, do solvente exercem
  profundos efeitos sobre todos os tipos de
  interações não covalentes.
• A tiouréia é um agente caotrópico mais eficiente
  que a uréia, mas pouco, solúvel em água.
• A mistura uréia-tiouréia é bastante eficiente.

Paba et al , 2004 Proteomics.
23
1. Preparação das amostras
Rompimento de interações não-covalentes

• 2. Detergentes
• Rompem interações hidrofóbicas,
• Para a focalização isoelétrica, não podem ter
  carga líquida. Devem ser não-iônicos ou
  zwitteriônicos,
• SDS deve ser evitado!!
• Os mais compatíveis com as necessidades são o
  Triton X-100 e o CHAPS

Paba et al, 2004 Proteomics
24
1. Preparação das amostras
3. Agentes Redutores

• 2-mercaptoetanol era usado nos primórdios. Sua
  ação tamponante destrói o gradiente de pH na
  região básica.
• DTT é o mais utilizado. Obs proteínas com muita
  cisteína não são totalmente reduzidas com DTT,
• Tributilfosfina (TBP) é o mais potente agente
  redutor disponível. Obs é volátil, tóxico e
  requer solvente orgânico para dissolver em água,
• Tris(carboxietil carboxietil) fosfine é uma
  fosfina hidrossolúvel.

25
Mantendo as proteínas intactas
1. Preparação das amostras

• Hidrolases (fosfatases, glicosidases e
  proteases),
• Proteases são resistentes à uréia e detergentes,
• Inibidores de proteases nem sempre são
  suficientes.
• Solubilização em SDS quente,
• Homogeinização da amostra em TCA diluído ou do
  TCA-acetona

Tripsina
26

1. Preparação das amostras
Remoção de sais

• Interferem no processo eletroforético.
• Eles migram através do gradiente de pH produzindo
  calor e acumulam-se nas duas extremidades.
• Zonas de alta condutividade - queda de voltagem e
  diminuição do campo elétrico.
• Proteínas não focalizam e aparecem como faixas.
• Os géis de focalização isoelétrica incham nessas
  zonas de alta condutividade devido ao acúmulo de
  água.
• Remoção por precipitação ou diálise.

27
2. Focalização Isoelétrica (IEF)

• As moléculas migram sob a ação de um campo
  elétrico em um gel contendo um gradiente de pH. A
  migração se interrompe ao atingirem seu ponto
  isoelétrico.
• Aplicada a moléculas que possam ser tanto
  positivamente ou negativamente carregadas
  (anfotéricas).

28
2. Focalização Isoelétrica (IEF)
As amostras possuem grupos ionizáveis

• Cadeias laterais das proteínas possuem
• grupos ionizáveis carboxílicos (Asp, Glu),
• aminos (Lys), imidazóis (His) e guanidino
• (Arg)

29
2. Focalização Isoelétrica (IEF)
As amostras possuem grupos ionizáveis

• A carga líquida de uma proteína é função da soma
  de suas cargas negativas e positivas. A carga é
  zero no seu ponto isoelétrico (pI),
• O pI de uma proteína pode ser alterado por
  modificações químicas como fosforilações,
• O pré-requisito para uma boa IEF é a formação de
  gradiente de pH estável e reprodutível.

30
2. Focalização Isoelétrica (IEF)
Gradientes de pH

• A focalização isoelétrica é realizada em géis de
  poliacrilamida contendo um gradiente de pH que
  pode ser de dois tipos
• Tampões anfotéricos (free carrier ampholytes)
• Gradientes imobilizados de pH (IPG)

31
2. Focalização Isoelétrica (IEF)
Tampões anfotéricos (free carrier ampholytes)

• CH2-N-(CH2)X -N-CH2-
• (CH2) X (CH2) X
• NR2 COOH
• R H ou -(CH2) X -COOH, X2
• Propriedadesboa condutividade e solubilidade no
  pI, alta capacidade tamponante, baixa interação
  com a amostra

32
2. Focalização Isoelétrica (IEF)
Gradiente de pH comampholytes

• Com o uso dos ampholytes o gradiente de pH é
  formado sob ação de um campo elétrico
• Desvantagens resultado depende do tempo de
  focalização, temperatura e efeitos endosmóticos.
• Westermeier, R. Electrophoresis in Practice, WCH

33
2. Focalização Isoelétrica (IEF)
Gradientes imobilizados de pH (IPG)
Strip Gel

• Gradiente formado com derivados de acrilamida
  contendo grupos tamponantes (Immobilines)
• CH2 CH-C - N - R
• O H R-grupo carboxílico ou
  amino
• Método altamente reprodutível
• Propicia uma alta capacidade de aplicação de
  amostra e uma baixa condutividade durante a
  focalização
• Géis prontos são disponíveis comercialmente

34
2. Focalização Isoelétrica (IEF)
Anfólitos carreadores
pH imobilizado (Immobilines)
35
3- Eletroforese desnaturante em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE)
SDS- Dodecil sulfato de sódio
Montagem do gel para a segunda dimensão
36
4. Detecção das proteínas nos géis
37
4. Detecção das proteínas nos géis
Revelação dos géis

• Coomassies R250 e G250
• Prata
• Fluorescência (Sypro, Pro-Q e Cy Dyes)
• Imunodetecção

38
Métodos de revelação

• Propriedades desejáveis
• Faixa dinâmica de detecção
• Sensibilidade
• Linearidade
• Reprodutibilidade
• Compatível com espectro de massa
• Baixa toxicidade
• Baixo custo.

39
Métodos de revelação

• 1 µg de Proteína

Revelação por Coomassie
Revelação pela Prata
(Lópes, 2007)
40
Revelação por Azul de Coomassie (COOMASSIE BLUE)

• Vantagens
• Intensa capacidade de coloração
• Elevada solubilidade em géis de poliacrilamida e
  agarose
• Capacidade de distinção entre pnt e Aa.
• Compatível com Espectro de Massa
• Estável na forma sólida
• Fácil manuseio
• Baixo custo.

(Fazekas de St. Groth et al., 1963)
41
(No Transcript)
42
Análise de géis corados com Comassie
43
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
José Maurício Maciel Cavalcante PPGCV-UECE
44
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
É uma metodologia de eletroforese (2D) onde é
utilizado até três diferentes amostras de
proteínas marcadas com corantes fluorescentes
(Ex. Cy3, Cy5, Cy2) antes da eletroforese 2D.
Após a corrida eletroforética, o gel é escaneado
com o comprimento de onda de excitação de cada
corante um após o outro. É utilizado para
observação de mudanças no perfil protéico entre
amostras.
Ex Perfil de proteínas de pacientes saudáveis e
doentes.

• Vantagem sobre a eletroforese 2D tradicional
• Evita diferenças do perfil eletroforético devido
  à variações entre géis
• Consome menos tempo

45
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
CyDye
Família cianinas (corantes sintéticos)
Três corantes com diferentes comprimentos de onda
de excitação e emissão
Cy2,Cy3 e Cy5
46
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
47
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
48
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
Marcação mínima (minimum labelling)
Corante ligado à N-hidroxi-succinimidila
(NHS) Ligação covalente ao resíduo de lisina
da proteína
49
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
Marcação mínima (minimum labelling)

• Marcação de 1-2 das proteínas disponíveis e
• ? apenas uma única lisina/proteína é
  marcada (um corante por proteína)
• Carga da lisina ? carga do CyDye pI da proteína
  não é alterado.
• Corante x PM das proteínas marcadas
• ? proteínas de baixa massa molecular
• Pode ser utilizado para espectrometria de massa

• Alta sensibilidade detecta até 125 pg de
  proteína

50
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
Marcação por saturação (saturation labelling)

• Apenas Cy3 e Cy5 podem ser modificados para
  técnica

• Usado para pequenas quantidades de proteína 5 µg

• Corantes ligados à maleimida
• ? ligação covalente ao grupo tiol dos
  resíduos de cisteína
• Todos os resíduos de cisteína são
  marcadas

• Corantes possuem carga elétrica neutra,
• ? não altera pI das proteínas

51
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
52
Eletroforese em gel diferencial (Difference gel
electrophoresis -DIGE)
Digitalização das imagens
Typhoon 9400 (GE Helthcare)
AutoradiografiaFluorescência excitação azul
(457, 488 nm) (Cy2)Fluorescência excitação verde
(532 nm)(Cy3) Fluorescência excitação
vermelho(633 nm) (Cy5)Quimoluminescência
53
5. Digitalização das amostras
Software para a análise de experimentos com DIGE
DeCyder (v7.0 - GE Healthcare)

• - Análise diferencial in-gel
• - Análise de variação biológica
• (entre geis)
• Módulo de análise estatística
• Remoção de artefatos
• Subtração background

Plataforma R124.195,40
54
Racional do gel 2D DIGE
55
2-D DIGE / Vantagens e desvantagens

• Menor tempo de análise,
• Alta sensibilidade (125 pg/spot),
• Maior acurácia nas comparações de proteínas entre
  diferentes amostras/ detecção de diferenças de
  10 nos níveis de expressão com 95 de confiança,
• Dificuldade de cortar spot para análise posterior
  (marcação posterior / spot picker),
• Caro!!!

56
Limitações da abordagem 2D-PAGE/MS

• Proteínas de membrana
• Proteínas com extremos de pI e MM
• Técnica trabalhosa
• De difícil automação
• Difícil reprodutibilidade
• Intervalo dinâmico de Mr
• Proteínas pouco abundantes (50-75)

Obrigado!
57
Limitações da eletroforese 2D
58
2D ou não 2D?

• Se o objetivo é prover uma lista de todas as
  proteínas presentes em uma amostra, metodologias
  baseadas em cromatografia multidimensional
  acoplada à espectrometria de massa em sequência
  (MS/MS) pode fornecer resultados superiores
• Se o objetivo for observar mudanças quantitativas
  na expressão de proteínas ou suas modificações
  pós traducionais durante um processo biológico,
  os géis bidimensionais ainda são inigualáveis.

59
Exemplo de trabalhos usando 2D