Genentech Founders

1

• ????

2
Genentech Founders

• 1973?Stanley Cohen ?Herbert Boyer
• DNA???????DNA???
  
• ??????????????
  
• DNA??
• pSC101 RSF1010
• pSC109
• E coli C600

3
????

• ????genetic engineering
• ??????????????,??????????????????????
• ????molecular cloning
• ??????????,????????????????,???? DNA ?????
• ??clone
• ???????????????????
• ??DNA???????

4
??? ???

• DNA ??????????????????,?????????????????
• ??????????????

5
????????(restriction enzyme)

• ?????????????DNA??????????,
• ??DNA???
• ???????
• ?????

6
1. ?????????

• II ???????????????????

7
2.?????????
EcoR I
?? ?? ?? ?? Escherichia coli R
I
8
3. II????????????

• ??????? 4-8 ???,??????,???????
• Rsa I EcoR I
  Not I
• GTAC GAATTC GCGGCCGC
• CATG CTTAAG CGCCGGCG
• ???? 6 ?????????????????? 464096 bp ???????
• ?????? BstE II EcoR II
• GGTNACC CC GG

A T
9
????

• ????
• ??5,??
• 3,??
• ??
• ?????????????

10
?????????

• ?????????,????????
• ??
• BamH I ?BstI-- G?GATCC
• Xho I? PaeR7 -- C?TCGAG
• ?????????,???????????
• BamH I
  Sau3A I
• GGATCC NGATCN
• CCTAGG NCTAGN

11
4. ?????????

• ????,?????????????
• DNA ????????
• ???????????
• DNA ?????(RFLP)?
• ???????????
• Mg2
• pH,????????
• ????,?????????Na?K?

12
????DNA??????
13
?????

• (1) DNA??? IMW 109KD
• 5,?3, ??
• ?? 3,?5, ?? ???
• 5,?3, ??
• ??????,cDNA?????,
• DNA 3,??????

DNA pol I
5
3
14

Klenow

• Klenow ??(76KD)
• ?? 5,?3, ???
• 3,?5, ?????
• ??DNA3?
• ??3??
• ??cDNA???
• DNA????
• Taq DNA???
• ??????(Thermus aquaticus)????
• ??????,72?????????
• ??? PCR?

???
15
2?????

• Reverse transcriptase,? RNA ???,???? DNA ???????
  cDNA ???
• ??AMV?MMLV
• ???????
• RNase H
• DNA pol
• ????????? RNase H ????
• ?????????

16
3?DNA???

• ??DNA?????,??????
• ?????????
• T4 ??? DNA ???
• ?ATP,??? RNA,
• ????????????
• ???????Ecoli DNA ligase
• ?NAD,???? RNA,???? cDNA???

17
4??????

• ????????(CAP)
• ???? DNA ? RNA 5,???????
• ?????????
• 5,?????
• ?????

18
5???????????

• ?????????????? DNA 3,????
• ??????????
• 3,?????????
• ??????
• DNA???????,
• ?????????

19
??? ??(vector)

• ???????????,????????????????
• ?????????
• ???
• ?????
• ?????
• ??
• ??????????????

20
?Ecoli????????

• ??
• ????
• ??
• M13???

21
????

• ???????????,?????DNA?
• ???????
• ???????
• ???????
• ?????????
• ?????????????????????,????????

22
??????????

• ????,?????????????,?????????
• ????,???????? 10 kb,??????????
• ?????????????,?????????,DNA ????,??????????????

23
???????

• ????pBR322
• ????????,
• ????????
• ?????
• ???????,
• ????????

24
???????

• pUC18 ? pUC19
• ????????????
• ?? lacZ ??,?????????
• ?????
• ??,??
• ??????
• pUC118/119
• ??M13?
• ?????
• ????

25
??????

• ???? DNA ???,???? 48.5 kb?
• ???? 12bp ????????COS
• ????????????????

26
???????

• ?????????,????????????????
• ???? DNA ? COS??,??????????? 75-105?
• ???? DNA ? 40????????????? 23 kb ????

27
???????

• ??????????????
• ???????????
• ?????0-13.5 kb
• ???????????
• ?????9-22.5 kb

28
???????

• Charon 40?????,?? 9.2-24.2 kb???
• EMBL 3?????,??????7-22 kb?
• Spi ??(?????P2?????????)?
• ?gt 10?????,?? 0-7.6 kb ???
• CI ??(??????????????)?
• ?gt 11?????,?? 0-7.2 kb ???
• LacZ???????
• ?DASH?????,?? 9-22 kb ???
• Spi??,T3 ? T7 ????
• ?ZAP?????,?? 0-10 kb ???
• ?? ColE1 ???,????????

29
????(cosmid)

• ???????COS????,??? 40-45 kb???

30
?????

• ??
• ??????????Ampr?Tetr
• ??cos??,???????
• ???????????
• ????,??????????????
• ??????,??????,??????
• ??
• ????????????????

31
?????????

• ????????,?????? DNA ???,?? 6.5kb??? M13 ??????
  f1?fd?
• M13 ?????? F ??????????
• M13mp18/M13mp19
• ?? lacZ ??,?????????,?????
• ????????,?????????,?????? DNA ???????

32
???? YAC??0.5-2MB
33
BAC??0.1-0.4MB
34
???? expressing vector

• ?????????????
• ??????
• ????????????????
• ??????????

35
(?)???????????????????

• ?????????
• ?,????
• ???????
• SD???????
• ????????

36
???????????

• ?????????
• ?,????
• ???????
• SD???????
• ????????

37
???????

• Tac ???
• Trp ? Lac ????????,?? Trp ????-35?,?????
  -10?,?? Lac ??????????????? LacI???
• ???????,?? IPTG ??,??????????
• T7??????????????,????? T7 RNA ????????????
• ?T7?????????????,???? IPTG ????
• ????pL??????????????(cIts857),?????????,???????

38
(No Transcript)
39
S D ??

• ??????????????? SD???
• SD???????????????????????

40
??????

• ????bp?800bp
• ???RNA??????????????????A/T?????G/C??,G/C????????
  ?

41
(No Transcript)
42
(?)????????

• ???????????????
• ?????????????
• ori??????MCS
• ???????????
• ???????????????????
• ????
• ????AAUAAA???
• ????????????,??????
• ?????????? (tk) ??????
• ?? (neor)?

43
(No Transcript)
44
??? ??DNA???????
45
?????????

• ?????????????????????,???????????????
• ??????????????????
• ?????
  
• ?????????PCR ???
• 
  ???????
• 
  ???????????
• ??????????????
• 
  ???????????

46
(?)?????DNA

• ????(genomic library)?????????????????,???????????
  ???? YAC???DNA?????????????DNA???
• ?????(shotgun)?
• ??????????????????????

47
(?)??cDNA

• cDNA??????????cDNA???????,????????DNA??????
• cDNA? mRNA ???,???????????? DNA?
• oligo(dT) ????????,RNA ????????????
• 5,??????

48
?? cDNA ??

• SMART
• Switch mechanism at RNA terminal

49
cDNA ???????

• cDNA ??????????????,???????????????
• cDNA ???????,???????????
• ??????? cDNA ??????,?????????????
• ??????????,??????????

50
(?)?????????

• ????????
• ????????,?????????????????DNA??????
• ????????,????????????

51
???????

• PCRpolymerase chain reaction
• ????????????????

52
????

• ?????????????(lt90nt)?
• ?????????????????????
• ??????????
• ?????
• ??????????
• ?????????
• ????

53
??????????

• ???????--????,??
• cDNA??--pUC
• ????--?????
• ????--pGEM?pBluescript II
• ????????
• ??????

54
?? DNA??????

• ???????????????????
• ????????
• ?????,???????
• ???????,??????????
• ????????
• ???????
• ??????
• T ??PCR ??????????

55
??????

• ???????,??????????
• ?????????????
• ?????????
• ???????????

56
?????????????
57
????

• ??????????????????????????
• ?????????
• ???????
• ???????????,?????????

58
??????

• ???????,??????
• ????????????????????,?????????????
• ???????????(SmaI)?????
• ????? 5,???? Klenow ?????
• ????? 3,???? T4 DNA?????????

59
?????????

• ????????? ???? DNA ?
• ???????? ???????

60
PCR ?????

• Taq DNA????????????A?
• ?? T??????PCR????????
• ???????DNA???????A?

61
?????DNA??????

• ??transformation
• ???DNA????????
• ?? DNA ? ??
• ??transfection
• ????????DNA?????
• ???
• ???? DNA ? ????
• ??infection
• ??????????????
• ?,???DNA???

62
???? DNA ??????

• ? DNA ?????????????????? DNA ????????
• ??CaCl2????,
• ?????????
• 42????,???
• ??????
• ????????
• ?????????

63
????????????

• ??????????????????????? DNA ??????????
• ????(in vitro packaging)??????,??????????COS???DN
  A??,???????
• ?? D ??(??)?E ??(??)?A ??(???? DNA??????,??COS????
  ????????? DNA )?
• ? ???? D ??? E ?????????
• ? ????????????
• ? ??? DNA ????????
• ? ??????

64
????

• ??

65
?????????????

• ??????
• ???????????
• ???????????
• a???????

• ?????

66
?????????

• ???? ????
• Tet r?????? CI??????, ?
• ??Tet
  r?????

67
lacZ???a??

• ???? lacZ?? N?,????? lacZ?? C ?????a???????????
• ?????? IPTG ??????????,?? X-gal ??,?? ????
• ??????????????,??????

68

• ?????
• PCR ???
• ?????
• ?????
• ????
• ????

69
??? ???????

• ??????
• ???????? DNA?????,???????
• ???
• ?DNA??????,?????????????? DNA ?????

70
??

• ???????????
• DEAE-dextran?DNA??,???????,??????????
• ????(microinjection)?????????,???????????????????
  ??????????
• DMRIE-C?lipofectamine2000?superfectamine?

71
?????????

• tk ????
• ?? tk ??????? tk ????????????????????????
  HAT ????????

72
(No Transcript)
73
dTMP ???
74

• neor ??????????
• G418????????,neor?
• ???????

75
??? ???????
?????????

• ????cDNA,???????????
• ?????????,????
• ?????????
• ???????????

76
????

• ?????
• ???????ATG??????,???????????
• ?????
• ???ATG??????,????????????????????????
• ?????
• ?????????,????????????,?????????????

77
??????

• ?????
• ???????ATG??????,???????????
• ?????
• ???ATG??????,????????????????????????
• ?????
• ?????????,????????????,?????????????

78
1. ???????

• ? pBR322 ??????
• ?? Tac ???,SD ??????????,rrnB (rRNA)??????
• ??
• ?????????????????????????
• ??????????
• ????????????,?????

79
2. ???????

• pGEX????
• Tac ????????S?????(GST)???????? GST ???
• ??
• ????????????????,???????
• ?????????,?????? X ?????
• GST ??????????,???????

80
??????

• GST ???????
• ?? GST ???????????,?????????
• ????X ???????,???????

• ?????????????
• pET ??????????(His)6?
• ?????????????

81
3. ???????

• ?????????????, N ??????????????????,C ???????
• ????????????,???????,?????????
• ??
• ????????????????
• ???????????????
• ????????????????
• ????????????

82
4. ???

• ?????????????????????
• ???????,?????????
• ?????????????,???????
• ????????????????,??????????????????????????????,??
  ????????

83
?? ?????????????

• ?????????
• ????????
• ?????????
• ???????
• ??
• ? ????,????,?????
• ? ??????,????????????
• ? ???????????,????????
• ????????

84
????????

• ???????????????
• ???????????
• ???????????????????
• ????
• ????AAUAAA???
• ????????????,??????
• ?????????? (tk) ??????
• ?? (neor)?

85
????????????

• ??????????????????
• ??????????????,??
• ????
• ????????,?????,??
• ?????
• ?????????????????
• ????,???????
• ?????

86
??????

• ???????,??CO2???,??????,
• ????????
• ????????

87
??????

• ????????,???????

88
??????

• ????
• ? ??????????????
• ? ??????????????????
• ???????????????????,?????????????????
• ????
• ? ??????????????
• ??????????????????
• ? ?????????????
• ????????AAV?????

89
??? ???????

• ?????????? mRNA?
• SDS-PAGE???????????,??
• ????????????
• ?????Western ????
• ?????
• ELISA

90
??? ?????????(SDM)????

• Site-directed mutagenesis
•  Site directed mutagenesis (SDM) is a powerful
  technique where site specific changes in DNA
  sequence are produced in vitro - for instance to
  change an amino acid residue into another by
  changing the codon sequence within the gene
  sequence. SDM is also used to 'engineer'
  commercially important proteins for many
  different purposes, for example
• improve stability 
• change specificity 
• reduce toxicity

91

• PCR mutagenesis can be used to produce either
  deletion or point mutations. A pair of
  oligonucleotide primers are used to amplify the
  sequence in order to introduce the mutation into
  the DNA products.

92
(No Transcript)
93
(No Transcript)
94
SDM???

• ??insulinchain B Thr27Arg
• chain A Asn21Gly
• C-terminal -NH2
• ??pI 5.4 pI6.8
• ????insulin??gt???
• ?????????chain B His27Asp