Vom Molek

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Vom Molekül zur ZelleBlock 3 Seminar /
Praktikum 2
Diese Präsentation befindet sich auf
derLehr-Inhalts Seite des Departments
unterwww.meduniwien.ac.at/Medbch/Teaching
Georg Weitzer, Ernst MüllnerMax F. Perutz
Laboratories (MFPL) Department für Medizinische
BiochemieMedizinische Universität Wien, Jan 2007
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Der praktische Teil der 2. Übung findet statt
amInstitut fürMedizinische Chemie Währingerst
raße 10Übungssaal I, 1. Stock
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Enymatische MethodenEnzymatische Reaktionen

• Enzym E
• Substrat S
• Produkt P
• Coenzym (Cosubstrat) CoE
• E S ES EP E P
• E S CoE ES-CoE EP-CoE E P
  CoE

Coenzym wird verändert (CoE, CoE), wird aber in
einer anderen Reaktion recyclet, daher auch der
Name Cosubstrat
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Was Sie wissen sollten

• Aktivität von Enzymen (Biokatalysatoren)
• wird beeinflusst durch
• pH- Wert (Optimim, aber auch Denaturierung)
• Temperatur (Optimum, aber auch Denaturierung)
• Hemmstoffe (in der Medizin Medikamente!)
• kompetitive (erhöhen den Km Wert)
• nicht-kompetitive
• Anmerkung bei der kompetitiven Hemmung
  konkurrieren ein Agonist (Substrat) und ein
  Antagonist (Hemmstoff) um die Bindungsstelle an
  einem Enzym. Bei der nicht-kompetitiven Hemmung
  bindet der Antagonist nicht an der
  Substrat-Bindungsstelle.

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Für die Reaktionsgeschwindigkeit v einer
enzymatischen Reaktion gilt
vmax x S v S Km
Michaelis-MentenGleichung
Km entspricht der Substrat-Konzentration, bei der
das Enzym mit der Hälfte der maximalen
Geschwindigkeit arbeitet.
Die Reaktionsgeschwindigkeit v einer
enzymatischen Reaktion in Abhängigkeit von der
Substratkonzentration S nach der
Michaelis-Menten Gleichung kann auch grafisch
dargestellt werden.
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Graphische Darstellung der Geschwindigkeit einer
enzymatischen Reaktion
Bestimmung derEnzymmenge
Bestimmung derSubstratkonzentration
v
v... Umsatzgeschwindigkeit
vmax ... Maximale Reak- tionsgeschwindigkeit
Km S bei vmax / 2 (Km
Michaelis-Menten Konstante) (S
Substratkonzentration)
... daher Km in mol/l
S
Abbildung aus Ergänzung der theoretischen
Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3
- Vom Molekül zur Zelle, Facultas Verlag, Hans
Goldenberg (Hg.)
es gilt bei Vmax/2 E ES
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Lineweaver-Burk Diagramm
Geradengleichungk Steigung
y k x x d ? y d k x x
1 / v 1 / vmax (Km / vmax) x 1 / S
Durch Umformung der Michaelis-Menten Gleichung in
eine doppelt-reziproke Form kann die
Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatischen
Reaktion in einem Linweaver-Burk Diagramm
dargestellt werden. Dies hat vor allem für die
Auswerung der Daten Vorteile.
k (1 / vmax) / (1 / Km)
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Beispiel 1
Kinetische Untersuchung der LactatdehydrogenaseB
estimmung der Km
Bestimmung derSubstratkonzentration
v
modiziert nach Ergänzung, H. Goldenberg
S
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Was macht die Lactatdehydrogenase?
Coenzym

• C2H5OH-COOH NAD CH3CO-COOH NADH H
  

gemessene Reaktionsrichtung
Pyruvat
Lactat

• Diagnose von Herzinfarkt durch die
  Aktivitätsbestimmung von herzspezifischen Enzymen
  im Blut
• Kreatinkinase (CK-MB)
• Laktatdehydrogenase

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Was macht NAD?Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid
ist ein Elektronen transportierendes Coenzym, das
an zahlreichen Redox-Reaktionen des Stoffwechsels
beteiligt ist. Dabei kann es reduziert werden und
maximal zwei Elektronen (dann geschrieben als
NADH) aufnehmen. Hier gezeigt am Beispiel der
Umwandlung (Oxidation) von Ethanol zu
Acetaldehyd.
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Absorptionsspektrum von NAD und NADH
Im Gegensatz zu NAD zeigt NADH ein starkes
Absorptionsmaximum bei 340 nm (langwelliges
UV-Licht). Im Zuge der Reaktion von Pyruvat zu
Lactat nimmt (durch gleich-zeitige Umwandlung von
NADH in NAD) die Absorption von UV-Licht ab.
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Messung der Lactatdehydrogenaseaktivität ... ...
und Darstellung der Ergebnisse in
einemLineweaver-Burk Diagramm
LDH spielt eine (Neben)rolle bei der Glykolyse im
Citratzyklus. Durch die Umwandlung von Lactat in
Pyruvat wird NADH produziert, das seinerseits als
energielieferndes Co-enzym der Atmungskette zur
ATP Bildung beiträgt. Im Praktikum wird hingegen
die Umwandlung von Pyruvat in Lactat gemessen,
wobei NAD gebildet wird.
-1 / Kapp
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Messen der Umsatzgeschwindigkeít bei
verschiedenen Substratkonzentrationen
S Pyruvat nochmals gemessen wird die
Reaktion in der Richtung vom Pyruvat zum Lactat,
wobei NADH in NAD umgewandelt wird. zunächst
Herstellung einer Verdünnungsreihe
Ergänzung, H. Goldenberg
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Probenvorbereitung
alle Volumina in µl
Ergänzung, H. Goldenberg
Durch Zugabe von 20 µl Lactatdehydrogenase wird
die Reaktion gestartet
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Arbeitsplatz
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Photometer
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Lambert-Beersches Gesetz
E e x c x d
E log (1/T) log (I0/I)
E Extinktion e spez. Molarer
Extinktionskeoff.c Konzentration d
Schichtdicke T Transmission
I
I0
Lichtquelle
Prisma
Küvette d 1 cm
Photometer
Detektor
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Messung der Lactatdehydrogenaseaktivität
niedrige Pyruvatkonzentration
hohe Pyruvatkonzentration
modiziert nach Ergänzung, H. Goldenberg
k v für gegebene S
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Messung der Extinktionsänderung bei jeder
Substratkonzentration
E e x c x d
c E / (e x d)
Dc / Dt DE / (e x d x Dt) v
Abnahme der Extinktion in Abhängigkeit von der
Dauer der Reaktion messen (wie in der Grafik
zuvor dargestellt).
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Auswertung der Messdaten durch Umwandlung in ein
Lineweaver-Burk Diagramm ...
Jedes k (Steigung links) entspricht einem Punkt
im Diagramm rechts
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... durch Eingabe in ein Computer-Datenblatt
(Excel, I)
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... durch Eingabe in ein Computer-Datenblatt
(Excel, II)
nicht alles muss immer stimmen ...
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Berechnung der vmax
Dc(s) / Dt DE / (e x d x Dt) v
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Geschafft!
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Beispiel 2Bestimmung der Lactatdehydrogenaseakti
vität im Serumbei verschiedenen Enzymmengen
Bestimmung derEnzymmenge
v
modiziert nach Ergänzung, H. Goldenberg
S
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Experimentelle Vorbereitungen
Ergänzung, H. Goldenberg
1. Lösungen 2 bis 4 mischen 2. LDH Lösung
zugeben 3. Abnahme der NADH Konzentration messen
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Gemessen wird wieder die Abnahme der Extinktion
pro Zeiteinheit, aber diesmal in Abhängigkeit von
der Enzymmenge
k DE / min
Zusatz von LDH
wenig Enzym
viel Enzym
modiziert nach Ergänzung, H. Goldenberg
Aktivität (U/l) DE / min x Konstante