disordini genomici strutturali e submicroscopici

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disordini genomici strutturali e submicroscopici

• Vincenzo Nigro
• Dipartimento di Patologia Generale
• Seconda Università degli Studi di Napoli

Telethon Institute of Genetics and Medicine
(TIGEM)
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portatori di un rischio riproduttivo indipendente
dal partner

• portatori di una traslocazione cromosomica
  bilanciata (reciproca)
• scambio di materiale genetico tra cromosomi non
  omologhi
• non vi è modificazione della dose genica
• frequenza 1/520 nati
• fenotipicamente normale

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traslocazioni bilanciate

• lo scambio di segmenti cromosomici avviene senza
  perdita di alcuna informazione genetica
• nessuna regione cromosomica è assente, ma è solo
  trasferita su un altro cromosoma
• ma un gene di fusione tra due geni altrimenti
  separati, un evento che è comune nelle cellule
  maligne

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traslocazioni bilanciate (meiosi e
fertilizzazione)
Traslocazione bilanciata
Segregazionealternata
Normale
Traslocazione
Segregazioneadiacente 1
Traslocazione
Trisomia
Segregazioneadiacente 2
Trisomia
La formazione di tetravalenti aiuta a capire
solo con la segregazione alternata si formano
gameti normali o con traslocazione bilanciata,
mentre le segregazioni adiacenti 1 e 2 portano
alla traslocazione sbilanciata o alla trisomia
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traslocazioni robertsoniane (rob)

• coinvolgono i cromosomi acrocentrici 13, 14, 15,
  21 e 22
• nessuna regione cromosomica è assente, perché
  questi contengono un braccio corto privo di geni
  che può risultare perduto con la fusione dei
  bracci q di due cromosomi acrocentrici
• La più frequente traslocazione Robertsoniana è la
  rob(13q14q) che rappresenta il 75 di tutte le
  rob
• segue poi la rob(14q21q) e la rob(21q21q)
• si formano in genere durante la meiosi femminile
  e comportano infertilità maschile o abortività
  ripetuta.

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Percentuale alla nascita di figli con cariotipo
sbilanciato da genitori con traslocazione
robertsoniana

• t(1314) MF 1
• t(1421) F 15 M 2
• t(2122) F 10 M 5
• t(2121) MF 100

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Traslocazione sbilanciata

• maggiori sono le dimensioni cromosomiche, minore
  è la possibilità di una gravidanza a termine
• minori sono le dimensioni, maggiore è il rischio
  di un feto malformato
• Sesso del genitore donnagtuomo (gli spermatozoi
  hanno il 7.5 di difetti contro l1 degli
  oociti, ma sono selezionati)
• Il rischio aumenta se il difetto è stato
  accertato a partire da un figlio precedente con
  cariotipo sbilanciato

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rischio alla nascita di figli con cariotipo
sbilanciato

• Se non vi sono stati casi in famiglia e la madre
  è eterozigote per una traslocazione reciproca il
  rischio è il 7
• Se non vi sono stati casi in famiglia e il padre
  è eterozigote per una traslocazione reciproca il
  rischio è il 3
• Se vi sono stati casi di traslocazioni
  sbilanciate in famiglia e la madre è eterozigote
  il rischio è il 14
• Se vi sono stati casi di traslocazioni
  sbilanciate in famiglia e il padre è eterozigote
  il rischio è l8

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inversioni

• Le inversioni sono rare (meno di 1 caso su 1000)
  e a volte difficili da mettere in evidenza
• Possono essere semplici quando comprendono due
  punti di rottura su di un singolo cromosoma
• Sono pericentriche quando il segmento invertito
  contiene il centromero (es 46, XX inv(3)p25q21)
• Le inversioni pericentriche dei cromosomi 1, 9,
  16 e Y sono eteromorfismi citogenetici di normale
  riscontro in soggetti sani
• Le inversioni sono dette paracentriche se
  confinate ad uno dei due bracci (es 46,XX.
  Inv(11)q21q23)
• Leterozigote per uninversione è un soggetto
  normale.

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coppia con familiarità per anomalie cromosomiche
è indicazione allesecuzione di un cariotipo
fetale e lestensione dellindagine ai parenti

• traslocazioni X-autosoma
• maschi sterili, femmine inattivano la X normale
• traslocazioni robertsoniane
• non 21 60 cariotipo bilanciato
• 21 15 rischio di Down, se è eterozigote la madre
  1 se è eterozigote il padre
• inversioni
• pericentriche varianti dell1, 9, 16 e Y, in
  altri casi il rischio è 5-10
• paracentriche, rischi inferiore allo 0.5

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donna eterozigote per una traslocazione
bilanciata X-autosoma
12
(No Transcript)
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disordine genomico submicroscopico

• un disordine genomico submicroscopico è una
  patologia causata da
• acquisizione
• perdita
• alterazione
• di uno o più geni contigui le cui variazioni di
  dosaggio possono produrre effetti fenotipici
• La base molecolare è rappresentata da
  riarrangiamenti genomici, quali duplicazioni,
  delezioni, inversioni, senza alterazioni
  apparenti del cariotipo (lt5Mb)

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dominanza e recessività

• in genetica, il carattere (o lallele) è
  dominante se leterozigote è indistinguibile
  dallomozigote
• in medicina la malattia è
• dominante fenotipo clinicamente manifesto con 1
  allele mutato
• recessiva fenotipo clinicamente manifesto con 2
  alleli mutati (omozigote o eterozigote composto)

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La maggior parte dei geni autosomici si trova
nella condizione A o C il dosaggio genico
critico è lt50. In tal caso, si osserva un
fenotipo patologico solo se entrambi gli alleli
sono colpiti I geni autosomici responsabili della
patogenesi dei disordini genomici si trovano
nella condizione B o D si osserva un fenotipo
già in eterozigosi per aploinsufficienza. Spesso
anche un dosaggio genico aumentato gtgt100 può
determinare una patologia
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aploinsufficienza

• insufficiente quantità di prodotto genico causata
  da una mutazione in eterozigosi
• la mutazione è di tipo allele amorfo o ipomorfo
• colpisce geni per i quali il 50 di prodotto
  genico non è abbastanza per garantirne la
  funzione
• spesso un dosaggio preciso è richiesto ai fattori
  di trascrizione e alle molecole di segnale
  espressi nel corso dello sviluppo

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In caso di delezioni del cromosoma X nei maschi
si osserva direttamente in fenotipo come sindrome
da geni contigui In caso di delezioni autosomiche
in eterozigosi, molto spesso il dosaggio
dimezzato non è causa di malattia. Quando si
osserva una sindrome da delezione, è risolutivo
trovare la stessa sindrome causata da una
mutazione puntiforme in uno solo dei geni. Se
questa non si trova, la sindrome esiste solo come
somma di più difetti.
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ACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCG
ACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCA
CACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACG
TAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTG
AAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGT
GCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACAC
ACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACC
GCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGG
GCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAAC
AGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTA
GCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACAC
AGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTC
GAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTC
TCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCT
CCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTA
GCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGAT
ATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGA
CCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGA
TATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGA
CACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTC
CTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATAT
AGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTG
ACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATA
GCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACA
GCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCT
CGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCG
CTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCT
GACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTC
GCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTC
GCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAG
ACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCC
CTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACC
GTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGAC
ACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACA
CCGCTCGAGACCTGACCTGAACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAG
GGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAA
CAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCT
AGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACA
CAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCT
CGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCT
CTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGC
TCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCT
AGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGA
TATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAG
ACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCG
ATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCG
ACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCT
CCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATA
TAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCT
GACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATAT
AGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACAC
AGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTC
TCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGC
GCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACC
TGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCT
CGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCT
CGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGA
GACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTC
CCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGAC
ACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCG
ACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCA
CACCGCTCGAGACCTGACCTGACCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTC
GCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTC
GCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAG
ACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCC
CTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACA
CGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGA
CACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCAC
ACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGT
AGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGA
AACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTG
CTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACA
CACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCG
CTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGCGAGACGT
AGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGA
AACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTG
CTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACA
CACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCG
CTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGG
CTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACA
GCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAG
CTAGCTCCTCTCGAGACGCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGAC
ACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACA
CCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTA
GGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAA
ACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGC
TAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACAC
ACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGC
TCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGC
TCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAG
CTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGC
TAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAG
ATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGA
GACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTC
GATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCC
GACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGC
TCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGC
TCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTG
ACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGC
TCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGC
TCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCG
AGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCT
CCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGA
CACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGC
GACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGC
ACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGAC
GTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCT
GAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACG
TGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACA
CACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACAC
CGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAG
GGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAA
CAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCT
AGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACA
CAGATATATAGCGGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAG
ATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGA
GATAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACAC
ACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACC
GCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGG
GCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCG
ATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCG
ACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCT
CCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGAT
ATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGA
CCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGA
TATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGA
CACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAG
GGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAA
CAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCT
AGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACA
CAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACC
TGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCG
ATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCG
ACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCT
CCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATA
TAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCT
TAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACAC
ACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGC
TCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGC
TCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGAT
ATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGAC
ACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCC
TCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACC
TGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATA
TAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACA
CAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGG
CTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATTATAGCTCGCGACACACA
CAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACC
TGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCG
ATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCG
ACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCT
CCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATA
TAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCT
TAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACAC
ACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGC
TCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTTATAG
CTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGA
CACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCAC
ACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGA
CGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCC
TGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACAC
GTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGAC
ACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACA
CCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATA
GCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACA
GCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCT
CGAGACGTAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATA
GCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGATAGCT
AGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGA
TATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAG
ACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCG
ATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGC
TCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGC
TCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCG
ACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGC
GCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACC
TGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCT
CGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCT
CGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTC
GATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCC
GACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGC
TCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGC
TCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTG
ACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGC
TCGCCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTC
GCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTC
GCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAC
GAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGC
TCACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCG
CGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCG
CACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGA
CGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCC
TGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACAC
GTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGAC
ACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACA
CCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTA
GGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAA
ACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGC
TAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACAC
ACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGC
TCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGC
TCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAG
CTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGC
TAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAG
ATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGA
GACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTC
GATATAGCTCGCGACACACACAGA
19
ACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCG
ACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCA
CACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACG
TAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTG
AAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGT
GCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACAC
ACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACC
GCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGG
GCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAAC
AGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTA
GCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACAC
AGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTC
GAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTC
TCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCT
CCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTA
GCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGAT
ATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGA
CCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGA
TATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGA
CACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTC
CTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATAT
AGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTG
ACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATA
GCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACA
GCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCT
CGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCG
CTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCT
GACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTC
GCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTC
GCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAG
ACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCC
CTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACC
GTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGAC
ACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACA
CCGCTCGAGACCTGACCTGAACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAG
GGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAA
CAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCT
AGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACA
CAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCT
CGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCT
CTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGC
TCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCT
AGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGA
TATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAG
ACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCG
ATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCG
ACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCT
CCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATA
TAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCT
GACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATAT
AGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACAC
AGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTC
TCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGC
GCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACC
TGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCT
CGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCT
CGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGA
GACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTC
CCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGAC
ACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCG
ACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCA
CACCGCTCGAGACCTGACCTGACCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTC
GCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTC
GCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAG
ACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCC
CTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACA
CGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGA
CACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCAC
ACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGT
AGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGA
AACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTG
CTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACA
CACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCG
CTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGCGAGACGT
AGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGA
AACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTG
CTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACA
CACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCG
CTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGG
CTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACA
GCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAG
CTAGCTCCTCTCGAGACGCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGAC
ACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACA
CCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTA
GGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAA
ACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGC
TAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACAC
ACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGC
TCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGC
TCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAG
CTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGC
TAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAG
ATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGA
GACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTC
GATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCC
GACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGC
TCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGC
TCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTG
ACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGC
TCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGC
TCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCG
AGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCT
CCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGA
CACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACTATATAGCGCTCCCTGAAACAGC
TCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACCGAGACGTAGG
GCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAAC
AGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTA
GCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACAC
AGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTC
GAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTC
TCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCT
CCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTA
GCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGAT
ATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGA
CCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGA
TATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGA
CACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTC
CTCTCGAGCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGAT
ATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGA
CCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGA
TATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGA
CACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTC
CTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATAT
AGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTG
ACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGCGAGACGTAGGGCTCT
CGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTC
CGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAG
CTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATA
TATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGAC
CTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGAT
ATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGAC
ACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCC
TCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATA
GCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGA
CCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAG
CTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAG
CTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTC
GAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGC
TCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTG
ACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCG
CGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACA
CACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCG
CTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTA
GGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAA
ACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGC
TAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACAC
ACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGC
TCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGC
TCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAG
CTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGC
TAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAG
ATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGA
GACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTC
GATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCC
GACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGC
TCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACC
TGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATA
TAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGGACGTAGGGCTCTCGATATAG
CTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAG
CTCGCACACCGCTCGAGATAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCG
ATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCG
ACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCT
CCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATA
TAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCT
CCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGA
CACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCT
CGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCT
CGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGA
GACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTC
CCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGC
TCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATAT
ATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACC
TGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATA
TAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCG
CGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCG
CACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACG
AGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCT
CCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGA
CACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGC
GACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGC
ACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGAT
ATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGAC
ACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCC
TCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATA
GCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCC
CTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACA
CGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCG
CGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCG
CACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGA
CGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCC
TGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTC
CTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATTA
TAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTCTCGATATAGCTCG
CGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCG
CACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGACG
AGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCT
CCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGA
CACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGC
GACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGC
ACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCTCGAT
ATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGAC
ACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCC
TCTCGAGACGTTATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGTAGGGCTC
TCGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCT
CCGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTA
GCTCCTCTCGACGAGACGTAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGACACACACA
GATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTCCGACACAGCTCGCACACCGCTCG
AGACCTGACCTGACACGTGCTAGCTAGCTCCTCTCGAGACGTAGGGCTCT
CGATATAGCTCGCGACACACACAGATATATAGCGCTCCCTGAAACAGCTC
CGACACAGCTCGCACACCGCTCGAGACCTTAGCTAGCTCCTCTCGAGACG
TAGGGCTCTCGATATAGCTCGCGA
Copy Number Variation 10 of the human genome
could vary in copy number
1
2
20
duplicazioni segmentali

• il genoma umano contiene complessivamente il
  13,7 di segmenti duplicati con almeno il 90 di
  identità di sequenza
• il 5,2 del genoma contiene segmenti duplicati
  lunghi tra 1 e 10kb, mentre il 4,5 tra 10kb e
  20kb
• i cromosomi più colpiti sono lY (50,4) ed il 22
  (11,9), ma anche il 7, 9, 10, 15, 16, 17 e X
• le duplicazioni segmentali possono essere
  intracromosomiche o intercromosomiche
• con tre localizzazioni differenti
• pericentromeriche (47Mb, dupliconi originati da
  altri cromosomi)
• subtelomeriche (ciascuna solo 50-100kb,
  orientate)
• interstiziali (solo nella specie umana sono
  disseminate ad una distanza media di 3Mb)

21
(No Transcript)
22
Malattie autosomiche dominanti

• Come fanno le delezioni in uno solo dei due
  alleli a costituire un carattere dominante?
• il livello dimezzato di prodotto genico è
  insufficiente a mantenere il fenotipo
• il difetto eterozigote diviene omozigote a
  livello delle cellule dei tessuti periferici
  (LOH)
• un solo allele è espresso per imprinting
  dellaltro

23
FISH
24
Sonde FISHle sonde FISH devono essere mirate,
non possono essere utili nellanalisi genomica
generale
telomero
centromero
intero cromosoma
locus
25
FISH
26
Sindrome di DiGeorge
27
DiGeorge/velocardiofacciale
La sindrome di DiGeorge del22q11.2 è la più
frequente sindrome da microdelezione, con un
incidenza di 1 su 40005000 nati La delezione
comprende 3Mb ed almeno 30 geni
28

• La migrazione di cellule della cresta neurale
  contribuisce alle strutture embrionali colpite
  nella sindrome di DiGeorge

29
DiGeorge

• È caratterizzata da
• Anomalie cardiache
• T-cell deficit
• palatoschisi
• anomalie facciali
• Ipocalcemia
• Mutazioni puntiformi del gene TBX1 possono
  portare a questi 5 tratti fenotipici, ma non alle
  difficoltà nellapprendimento che è invece
  frequente nella sindrome da delezione

30
Williams-Beuren

• prevalenza alla nascita 1/7500-1/20.000, ma può
  non essere diagnosticata

31
Williamsuna delezione tipica
32
Williamsgenetica

• delezione de novo
• trasmissione autosomica dominante
• delezione di 1.6MB da 21 geni contigui in
  eterozigosi a 7q11.23
• gene dellelastina
• LIM kinase 1 (LIMK1)
• CLIP-115 che lega i microtubuli
• Fattori di trascrizione GTF2I e GTF2IRD1
• effetto posizionale su altri geni circostanti la
  delezione

33
FISH della s. di Williams delezione 7q11.23

• rilevabile mediante FISH ma non cariotipo

34
Williamscomportamento

• lieve o medio ritardo mentale (IQ tra 41 e 80)
• scarsa capacità di concentrazione
• ritardo nellapprendimento del linguaggio e poi
  esagerata loquacità
• personalità amichevole e affettuosa
• danno facilmente confidenza anche a sconosciuti
• ansietà, spesso preoccupati per il benessere
  altrui
• ipersensibilità ai suoni
• memoria visiva e uditiva spesso fuori dal comune
• ricordano persone, luoghi e motivi musicali
• predisposizione ad imparare le lingue e la musica

35
Williamsaspetto e segni

• Faccia da elfo
• Occhi blu (77) con pattern stellato delliride
  (74) ma questo vale per i nordeuropei, strabismo
  (40)
• Naso con la punta bulbosa
• bocca larga e guance piene
• microdontia e micrognazia
• Statura 10 cm in meno del normale
• ipercalcemia
• stenosi periferica delle arterie polmonari
• stenosi aortica sopravalvolare

36
http//www.wsf.org/family/photoalbum/wsfphoto.htm
Williamsfoto
37
Williams foto
38
Wolf-Hirschhorngenetica

• delezione de novo di circa 4MB
• le delezioni sono più frequenti nella linea
  germinale maschile
• trasmissione autosomica dominante
• Regione critica di 165 kb di molti geni contigui
  in eterozigosi a 4p16.3

39
Wolf-Hirschhorndelezione a 4p16.3
40
Wolf-Hirschhorn

• Scarso accrescimento
• Ritardo mentale, ipotonia
• Labbro leporino
• Conformazione ad elmo di guerriero greco

41
Sindrome 5p- (cri du chat)150.000 nati

• Pianto acuto e flebile
• Caratteristiche principali
• Ritardo di crescita
• Microcefalia ed ipertelorismo
• Ipotonia, diastasi dei retti
• Deficit intellettivo e del linguaggio

42
imprinting

• una piccola parte del genoma umano presenta
  differenze significative nellespressione a
  seconda se un gene è ereditato dal padre o dalla
  madre
• se due cromosomi sono provenienti dallo stesso
  genitore (disomia uniparentale) e non da entrambi
  i genitori, si determina morte o malattia
• alla base di queste differenze cè limprinting
  genomico
• è dovuto a modificazioni epigenetiche (non
  correlate alla sequenza primaria del DNA)
• comporta l'aggiunta di un gruppo metile (CH3)-
  alla posizione 5 di un residuo di citosina nel
  DNA che precede immediatamente un residuo di
  guanina (CpG).

43
Imprinting
44
Imprinting

• Nelle cellule germinali primordiali limprinting
  viene cancellato del tutto e il DNA è demetilato
• Successivamente nella linea germinale maschile si
  determina un pattern di imprinting che in alcuni
  loci è complementare a quello della linea
  germinale femminile
• I cromosomi su cui avviene limprinting (7, 11,
  15) manterranno questo pattern e lo riprodurranno
  ad ogni mitosi
• Si potranno sempre distinguere lespressione
  genica del cromosoma materno e paterno

45
Disomia uniparentale

• Due copie dello stesso cromosoma sono ereditate
  dallo stesso genitore
• Spesso questo avviene attraverso un fenomeno
  transitorio di trisomia, seguito dalla perdita
  del cromosoma singolo e mantenimento del
  cromosoma doppio

46
Angelman

• 70 dei casi delezione della regione cromosomica
  15q11-q13, che è soggetta al fenomeno
  dell'imprinting del cromosoma paterno
• Il gene materno (l'unico espresso) può essere
  alterato con 4 meccanismi noti
• delezione
• disomia uniparentale paterna
• difetti nell'imprinting
• mutazioni a carico del gene UBE3A (ubiquitin
  ligasi)
• La diagnosi è clinica e il difetto genetico non
  si identifica nel 20 dei casi

47
(No Transcript)
48
Angelman

• "happy puppet syndrome" si può identificare in
  Cucciolo (Dopey) "addormentato", il più giovane
  dei nani che non ha mai imparato a parlare
• ritardo mentale con assenza del linguaggio,
  difficoltà nell'equilibrio, eccessivo buon umore

49
Angelman

• L'incidenza è 1/20.000 nati
• crisi epilettiche e comunque alterazioni dell'EEG
  e microcefalia relativa

50
Prader-Willi

• iperfagiagtobesità
• eccessiva assunzione di liquidi
• reazioni abnormi ai sedativi
• acromicria, criptorchidismo
• insensibilità al dolore, lesioni cutanee
• sbalzi di umore

51
Prader-Willi
1/15.000
52
Nomenclatura delle delezioni

• Le delezioni sono designate con la sigla del che
  segue i numeri dei nucleotidi a monte e a valle
  della delezione separatida un segno _
• 82_83del (o 82_83delTG) indica una delezione di
  TG nella sequenza ACTTTGTGCC (dove A è il
  nucleotide 76) che diventa ACTTTGCC

53
Cosa sono le distrofie muscolari?

• Malattie degenerative progressive
• Variazione dello spessore delle miofibrille con
  forti cambiamenti nella istologia del muscolo
• indebolimento e degenerazione del tessuto
  muscolare in fibroso e adiposo
• aree di necrosi con processi infiammatori

54
Duchenne Becker
cingoli
distale
Emery- Dreifuss
facio-scapolo- omerale
oculo- faringea
55
Distrofia muscolare Duchenne/Becker

• DMD Duchenne - 1/3,500 maschi
• Insorgenza -- Infanzia - tra 2 e 6 anni
• Sintomi Debolezza generalizzata e danno
  muscolare prima agli arti e al tronco, polpacci
  ingrossati
• Progressione Lenta ma inesorabile. Colpisce
  tutti i muscoli volontari. Sopravvivenza fino a
  25-30 anni
• BMD Becker - 1/10,000 maschi
• Insorgenza Adolescenza o dopo
• Sintomi Identici alla DMD ma più attenuati. Vi
  è coinvolgimento cardiaco significativo
• Progressione Più lenta e più variabile della
  distrofia di Duchenne con buona aspettativa di
  vita

56
Le delezioni intrageniche del gene della
distrofina mandano fuori cornice la lettura delle
triplette quando gli esoni cancellati contenevano
un numero di nucleotidi che non è multiplo esatto
di tre (1,2,4,5,7,8,10,11 ecc). Questo causa la
distrofia di Duchenne.
57
(No Transcript)
58
Le delezioni intrageniche che non alterano la
cornice di lettura portano alla distrofia
muscolare di Becker o ad un apparente buona
salute. Forniscono informazioni per preparare
delle microdistrofine per la terapia genica
59
Nomenclatura delle delezioni

• Le delezioni sono designate con la sigla del che
  segue i numeri dei nucleotidi a monte e a valle
  della delezione separatida un segno _
• 82_83del (o 82_83delTG) indica una delezione di
  TG nella sequenza ACTTTGTGCC (dove A è il
  nucleotide 76) che diventa ACTTTGCC

60
La tecnica del CGH (comparative genomic
hybridization) permette lindividuazione di
sequenze delete o duplicate nel genoma da testare
(red) mediante il confronto con un genoma di
riferimento (green). Sono preparate due sonde
fluorescenti di colore diverso che ibridano
contemporaneamente sui cromosomi. Se in una
regione cromosomica prevale il colore (green)
relativo al genoma di controllo questo significa
che il genoma da testare (red) ha una delezione
in quella regione
61
(No Transcript)
62
DNA di controllo
DNA del paziente
Aggiungere DNA Cot-1
Ibridazione
CGH
CGH array
Analisi delle immagini con software dedicati
63
Agilent Technology
64
Evoluzione del catalogo delle sonde già testate
Human CGH High Density (HD) Database
65
Agilent Manufacturing Facility
66
Formati dei Microarray Agilent
67
44,000-oligonucleotide with 8,769 interrogating
probes (60-mer oligonucleotides) Agilent
Technologies average spacing of probes across the
DMD coding region of at least one every 144 base
pairs digestion with AluI and Rsa I and
labeling Agilent CGH-Analytics V3.4s software
F
F
68
9293 probes that were replicated twice
(Agilent) remaining spots on each 44 K array were
filled with probes from the X chromosome (11745)
and all of the autosomes (12053) CGH Analytics
software (v3.5)
69
microarray-based mutation detection in the
dystrophin gene (Nimblegen)

• 385,474 probes spanning the 2,222,000 bases of
  the dystrophin gene on chromosome X
  31,046,00033,268,000
• probe lengths from 45 to 60 nt with isothermal
  melting temperature
• DNA samples sonicated to a size between 500 and
  2,000 bases
• Labelling with Klenow and Cy3 or Cy5

Exon 44
70

• Normalized log2 ratio data were analyzed using
  two different analysis programs
• (SegMNTor DNA copy) NimbleScan
• Gain and Loss Analysis of DNA (GLAD)
  (www.bioconductor.org)

DNA copy
dup 2-4
GLAD
DNA copy
del 44
GLAD
71
(1, gain 0, normal and1, loss),
del 17-44
del 48-52
72
Solo la CGHarray riesce a chiarire la mutazione
nelle donne portatrici di una delezione o
duplicazione del cromosoma X. A causa della
presenza del secondo cromosoma X normale sono
difficili da identificare con altre tecniche
del 46-55
del 49-50
dup 18-38