UV-vis-spectrometry applications, Flow Injection Analysis

1
Moleküler Lüminesans Spektroskopi Floresans ve
Fosforesans Uygulamalari
Etkin Kimyagerler Egitimleri Faydali olmasi
dilegiyle
Yüksek Kimyager Hasan ÖZ
2
Çalisma ilkesi Bu yöntemlerin her birinde,
analit molekülleri, emisyon (floresans,
fosforesans ve kemilüminesans) spektrumlari
kalitatif veya kantitatif bilgiler saglayacak
sekilde uyarilir. Floresans, floresanstan
sorumlu elektronik enerji aktariminin elektronun
spininde bir degisiklik olusturmamasi ile
fosforesanstan ayrilir. Bunun bir sonucu olarak,
floresans hemen yok olan (lt 10-5 -5s) bir
lüminesans olup, kisa ömürlüdür. Buna karsilik
fosforesans emisyonlari ile iliskili elektron
spinindeki bir degisme, isinlamanin bitmesinden
sonra kolayca tespit edilebilir bir süre kadar,
genellikle birkaç saniye veya daha uzun, isimanin
sürmesine sebep olur. Bir çok durumda, floresans
veya fosforesans olarak foto lüminesans emisyonu,
onu uyarmak için kullanilan isimaninkinden daha
uzun dalga boyundadir.
3
FLORESANS Ve FOSFORESANS Floresansin en basit
tipi, seyreltik atomik buharlarin gösterdigi
floresanstir. Örnegin, buhar halindeki sodyum
atomlarinin 3s elektronlari, 589,6 ve 589 nm lik
dalga boylarindaki isinlarin absorpsiyonu ile 3p
enerji seviyesine uyarilabilir. 10-5 - 10-8 s
sonra, elektronlar temel duruma geri döner ve her
yöne dogru, ayni iki dalga boyunda isin yayar.
Frekansta degisiklik olmaksizin absorplanan
isinin yeniden yayilmasini kapsayan floresansin
bu tipi rezonans isimasi veya rezonans floresansi
olarak bilinir.
paramanyetik olarak adlandirilir.
4
Birçok moleküler tür, rezonans floresansi da
gösterir. Bununla beraber çok sik olarak,
moleküler floresans veya fosforesans bantlari
rezonans çizgisinden daha uzun dalga boylarinda
merkezlenmis olarak bulunur. Bu uzun dalga
boylarina veya düsük enerjilere kayma stokes
kaymasi olarak ifade edilir.Uyarilmis
elektronik halin enerji kaybetmesi, fosforesans
yoluyla da olabilir . Triplet bir halde sistemler
arasi geçisten, sonra, iç veya dis dönüsüm veya
fosforesans ile biraz daha sönüm olabilir.
5
Elektron SpiniPauli disarlama prensibi, bir
atomdaki iki elektron için dört kuantum sayisinin
hepsinin birden ayni olamayacagini belirtir. Bu
sinirlama, bir orbitalde iki elektrondan daha
fazla elektron bulunmamasini ve ayrica iki
elektronun da zit spinli olmasini gerektirir. Bu
sartlar altinda, spinler eslesmistir. Spin
eslesmesi sebebiyle, moleküllerin çogu net
manyetik alan göstermez ve bu yüzden diamanyetik
olarak adlandirilir. Yani bunlar, durgun
manyetik alan tarafindan ne çekilir ne de
itilirler. Buna karsilik, eslesmemis elektronlar
içeren serbest radikallerin bir manyetik momenti
vardir ve bunun sonucu olarak bir manyetik alan
tarafindan çekilir. Bu yüzden serbest radikaller
paramanyetik olarak adlandirilir.
6
Singlet/ TripIet uyariImis HallerBütün elektron
spinlerinin eslesmis oldugu bir moleküler
elektronik hal bir singlet hal olarak
adlandirilir ve molekül bir manyetik alana maruz
birakildiginda elektronik enerji seviyelerinde
hiçbir yarilma meydana gelmez. Diger taraftan,
bir serbest radikal için temel hal bir dublet
halidir. Çünkü, tek elektronun bir manyetik alan
içinde, sisteme çok az farkli enerjilerde katki
yapan iki yönlenmeye sahip oldugu kabul
edilebilir.Bir molekülün bir çift elektronundan
biri daha yüksek bir enerji seviyesine uyarilirsa
ya bir singlet ya da bir triplet hal meydana
gelir.
7
Seçim Kurallari S ?? S T ?? T
S ?/? T
8

• Uyarilmis triplet halinin ,karsisina gelen
  uyarilmis singlet halden daha düsük olduguna
  dikkat edilmelidir. Singlet/triplet
  geçisinin,karsi gelen singlet/singlet geçisine
  göre önemli derecede daha az mümküdür. Bunun
  sonucu olarak,bir uyarilmis triplet halinin
  ortalama ömrü 10-4 s'den birkaç saniyeye kadar
  uzayabilir. Bir uyarilmis singlet halinin
  ortalama ömrü ise 10-7 ile 10-8 s kadardir.
  Temel haldeki bir molekülün isinla , uyarilmis
  triplet hale uyarilmasi ,düsük bir olasiliga
  sahiptir ve bu islem sonucu olusan absorpsiyon
  piklerinin siddeti ,benzer sekilde
  singlet/singlet geçisine karsi gelenlerininkinden
  bir kaç kat ondalik mertebesi daha düsüktür.
  Bazi moleküller ,bir uyarilmis triplet haline
  geçebilir.Bu olayin nihayi sonucu,genellikle
  fosfersanstir.

9
(No Transcript)
10
Bir isin fotonunun absorplanma hizi çok
büyüktür. ( 10-14 -14 - 10-15-15 s) Fakat
floresans emisyonu önemli derecede daha yavas
hizda olusur. Burada, uyarilmis halin
ömrü, uyarilma islemine karsilik gelen
absorpsiyon pikinin molar absorptivitesi ile ters
orantilidir. Bu nedenle, 3 103 - 105 5
araligindaki molar absorptiviteler için uyarilmis
hallerin ömrü 10-7 -7 - - 10-99 s'dir. .
Tripletten singlete geçisin ortalama hizi, buna
karsilik gelen singlet-singlet geçisininkinden
daha azdir. Bu nedenle, Fosforesans emisyonu 4
10-4 10 s veya daha fazla bir süre gerektirir.

Absorpsiyon ve Emisyon Hizlari
11
Titresimsel Durulma
Elektronik uyarilma sirasinda bir
molekül birçok titresim seviyesinden herhangi
birine uyarilabilir. Bununla beraber, çözeltide,
asiri titresim enerjisi, uyarilmis türlerin
molekülleri ile çözücü molekülleri arasindaki
çarpismalar sonucu hemen kaybedilir sonuç, bir
enerji aktarimi ve çözücü sicakligindaki çok az
bir artistir. Titresim enerji seviyeleri
bakimindan uyarilmis bir molekülün ortalama
ömrü10-12 s veya daha az olup, bu süre elektronik
olarak uyarilmis bir halin ortalama ömründen
önemli derecede daha kisa oldugundan, durulma
islemi çok etkilidir. Sonuç olarak, çözeltiden
floresans oldugu zaman, bu floresans daima
uyarilmis bir elektronik halin en düsük titresim
seviyesinden bir geçis ile ilgilidir. Bununla
beraber, elektron, temel halin titresim
seviyelerinden herhangi birine dönebilecegi için,
birbirine yakin birçok pik olusur. Daha sonra,
daha fazla titresimsel durulma ile elektron,
hizla temel elektronik halin en düsük titresim
seviyesine dönecektir.
12
Iç dönüsüm
Iç dönüsüm terimi, bir molekülün, isin
yaymadan daha düsük bir elektronik enerji
seviyesine geçmesi ile ilgili molekül içi
olaylari ifade eder. Bagil olarak çok az
bilesigin floresans göstermesi bunlarin
genellikle çok etkili olduklarinin açik
göstergesidir.
13
(No Transcript)
14
Iki elektronik enerji seviyesi,titresim
enerji seviyelerinde bir örtüsme gösterecek kadar
birbirlerine yakinsaiç dönüsüm özellikle
etkilidir.Bu durum sekilde gösterilmistir.Gösteril
en örtüsmelerde uyarilmis iki halin potansiyel
enerjisi aynidirbu esitlik açik olarak etkili
bir geçise izin verir.
15
Dis Dönüsüm
Uyarilmis bir elektronik halin
sönümlenmesi, uyarilmis molekül ve çözücü veya
diger çözünenler arasindaki etkilesimi ve enerji
aktarilmasini içerebilir. Bu olaylara topluca dis
dönüsüm veya çarpisma ile sönüm denir. Dis
dönüsüm için delil, çözücünün floresans siddeti
üzerindeki, kuvvetli etkisini içerir ayrica
tanecikler arasindaki çarpisma sayisini azaltan
kosullar (düsük sicaklik ve yüksek viskozite)
genellikle floresansi azaltir. Dis ve iç
dönüsümler, fosforesans ile o kadar basarili bir,
sekilde rekabet ederler ki, normal olarak bu tür
emisyon, sadece düsük sicakliklarda çok viskoz
ortamlarda veya kati yüzeyle absorplanmis
moleküllerde gözlenir.
16
Sistemler Arasi Geçis
Sistemler arasi, geçis, uyarilmis bir
elektronun spininin ters döndügü bir olaydir ve
molekülün multiplisitesinde bir degisme olur.
Iç dönüsümde oldugu gibi, eger iki halin
titresim seviyeleri, örtüsürse/bu geçisin
olasiligi artar. Singlet/triplet geçisi
buna bir örnektir burada, en düsük singlet
titresim seviyesi, daha yüksek triplet titresim
seviyelerinin biri ile örtüsmektedir ve böylece
spin halinde bir degisme daha muhtemeldir.
Sistemler arasi geçis, iyot veya brom gibi agir
atomlari içeren moleküllerde çok yaygindir.
17
FLORESANS VE FOSFORESANSI ETKILEYEN DIS
DEGISKENLER
KUANTUM VERIMI Floresans veya fosforesans
için kuantum verimi veya kuantum verimi orani
basit olarak lüminesans yapan moleküllerin
sayisinin toplam uyarilmis molekül sayisina
oranidir.Floresin gibi oldukça floresans bir
molekül için bazi sartlar altindaki kuantum
verimi bire yaklasir.Önemli derecede floresans
yapmayan kimyasal türler sifira yakin verimlere
sahiptir.
kf floesresans bagil hiz
sabiti ks sistemler arasi geçis
kdd dis dönüsüm
kid iç dönüsüm
köa ön ayrisma
ka ayrisma

18
Floreasansta Geçis Tipileri
Floresans (veya fosforesans) isini
elede etmede kullanilan isinlarin dalga boylari
genel olarak 250 nm'den daha büyük
olmalidir.(Çünkü daha küçük dalga boylu isinlar
molekülde dissosyasyon(ayrisma) ve hatta
parçalanmalara neden olur.Dissosyasyon da
floresansi azaltan bir olaydir.)
Floresans isinlari genel olarak
p ? p p? n
geçislerinden meydana gelir. Bu iki geçisten
de daha çok p ? p geçislerinden meydana
gelir. Böyle geçislerden meydana gelen
floresanslar ayni zamanda siddetli olan
floresanslardir.Bunlarin kuvantum verimi de
yüksektir.
19
Floresans ve Yapi
En siddetli ve en faydali floresans, düsük
enerjili ? ?? geçislerine sahip aromatik
fonksiyonel gruplan içeren bilesiklerde görülür.
Alifatik ve alisiklik karbonil
gruplarin veya fazla sayida konjüge çift bagli
yapilar içeren bilesikler de floresans
gösterebilir, ancak bunlarin sayisi aromatik
sistemlerin sayisi ile karsilastirildiginda daha
azdir. Sübstitüe olmamis bir çok
aromatik hidrokarbon çözeltide floresans
yapar.Kuvantum verimi genellikle halka sayisi ve
kondensasyon derecesi ile artar.
20
Piridin ,furan ,tiyofen ve pirol gibi
heterosiklik maddeler floresans göstermezler.
21
Azotlu heterosiklikler de en düsük enerjili
elektronik geçisin,hizlica triplet hale dönüsen
ve floresansi önleyen n? p sistemi ile ilgili
oldugu kabul edilir.Bunula beraber ,bir
heterosiklik çekirdek olusturmak üzere benzen
halkalarinin birlesmesi absorpsiyon pikinin molar
absorptivitesinde bir artisa sebep olur.Böyle
yapilarda uyarilmis bir halin ömrü daha
kisadirbu yüzden kinolin,izokinolin ve indol
gibi bilesikler için floresans gözlenir.
22
Benzen halkasindaki sübstitüsyon
absorpsiyon maksimumunun dalga boyunda kaymaya ve
karsi gelen floresans piklerinde degismelere
sebep olur.Sübstitüsyon genellikle floresans
verimini etkiler,bu etkilerin bazilari çizelgede
benzen türevleri için verilmistir. Halojen
sübstitüsyonunun etkisi dikkate
degerdirhalojenin atom numarasi arttikça
floresansin azalmasinin ,triplet hale sistemler
arasi geçis olasiligini arttiran agir atom
etkisinden dolayi oldugu düsünülür.Iyodobenzen ve
nitro türevlerinde de önayrismanin önemli bir rol
oynadigi düsünülür,bu bilesiklerbu bilesikler
iç dönüsümden sonra uyarma enerjisini
absorplayabilen kolayca kopan baglara sahiptir.
Bir aromatik halkaya bir karboksilik asit
veya karbonil grubunun sübstitüsyonu genellikle
floresansi durdurur.Bu bilesiklerde, n? p
geçisinin enerjisi, p ? p geçisinkinden daha
azdir,n? p sistemin floresans verimini normal
olarak düsürür.
23
Benzenin Floresansina Sübstitüsyonun Etkisi
(Etanol çözeltisinde)
24
YAPISAL RIJITLIGIN ETKISI
Floresans rijit yapilara sahip
moleküllerde özellikle daha fazla oldugu ampirik
olarak bulunmustur.Örnegin floren ve bifenil
için kuvantum verimleri ,benzer ölçme
kosullarinda sirasiyla yaklasik 1.0 ve
0,2'dir.Davranistaki bu farklilik ,baslica
florendeki metilen frubunun köprü yapmasiyla
olusan rijit artisinin bir sonucu olarak ortaya
çikar.
25
Rijitligin,bir metal iyonu ile kompleks
olusturduklari zaman selat olusturucu bazi
organik maddelerin floresansindaki artisindan
sorumulu oldugu düsünülmektedir.Örnegin
8-hidroksikinolin floresans siddeti çinko
komplesinden çok daha azdir.
26
FLORESANS ÜZERINE GRUPLARIN ETKISI
Elektron donörü olan -NH2 ,-OH gibi
gruplar floresansi arttirdigi halde,
elektron akseptörü olan -NO2 ,-X(halojenürler)
-COOH, -CHO, -NN- gibi gruplar floresansi
azaltir ve bazen ortadan kaldirir.
27
SICAKLIK ve ÇÖZÜCÜ ETKILERI
Bir çok molekülde floresansin kuavntum
verimi sicaklik arttikça azalir. Yüksek
sicakliklarda çarpisma frekansinin artmasi dis
dönüsüm ile sönme olasiligini arttirir.Çünkü
viskositesindeki azalma da benzer sekilde dis
dönüsümü artirir ve ayni sonuca götürür.
Bir molekülün floresansi ,agir atomlari veya
yapilarinda bu atomlarin oldugu diger çözünenleri
içeren çözücüler varliginda azalirkarbontetrabrom
ür ve etiliyodür buna örnektir.Bu etki ,agir
atomlarin floresans yapan bilesiklerde
sübstitüent olarak bulundugu durumdakine
benzerorbital spin etkilesimleri triplet olusum
hizinda bir artisa ve dolayisiyla floresansta bir
azalisa sebep olur.
28
FLORESANSA pH'nin ETKISI
Asidik veya bazik sübstitüentleri içeren
bir aromatik bilesigin floresansi genellikle
pH'ya baglidir. Bilesigin iyonlasmamis ve
iyonlasmis halleri için dalga boyu ve emisyon
siddetinin her ikisi de farklidir.Fenol ve anilin
için bu etkiyi gösteren veriler Çizelge de
verilmistir.Bu tip bilesiklerin emisyonundaki
degismeler moleküllerin asidik ve bazik formlari
ilgili rezonans türlerinin farkliligindan
kaynaklanir.Örnegin,anilinyumun bir tane iken
anilinin bir çok rezonans hali vardir
29
Ilave rezonans formlari daha kararli
birinci uyarilmis hale yol açarbunun sonucunda
ultraviyole bölgede floresans olur.
Floresansa dayanan analitik islemlerde genellikle
siki bir pH kontrolü gerekir.
30
Bir çözeltide,çözünmüs
oksijenin varligi,genellikle floresans siddetini
azaltir.Bu etki,floresans yapan türlerin
fotokimyasal olarak yükseltgenmesinin bir sonucu
olabilir. Yaygin olarak moleküler oksijenin
paramanyetik özellikleri sonucu olarak sönüm
meydana gelir ve sistemler arasi geçis ve
uyarilmis moleküllerin triplet hale geçisi
artar. Diger paramanyetik türler de
floresansi azaltma egilimindedir.
ÇÖZÜNMÜS OKSIJENIN ETKISI
31
Derisimin Etkisi
Floresans siddeti F, düsük derisimlerde
derisim ile orantilidir. FKC
Yüksek derisimlerde kendi kendine sönüm ve kendi
kendine absorpsiyon nedeniyle negatif sapma
gösterir.
32
EMISYON VE UYARMA SPEKTRUMLARI
200 300 400
500 600 nm
200 300 400 500 nm

33
Bir uyarma spektrumu, uyarma dalgaboyu
degistirilirken, sabit dalgaboyunda lüminesansin
ölçülmesiyle elde edilir. (ayni sartlarda elde
edilen absorpsiyon spektrumu ile aynidir).
Floresans ve fosforesans spektrumlari
dalgaboyunun bir fonksiyonu olarak emisyon
siddeti kaydedilirken sabit dalgaboyunda
uyarilmayi kapsar. Fotolüminesans
genellikle uyarma dalgaboyundan daha uzun
dalgaboylarinda olur. Ayrica fosforesans bantlari
floresans bantlarindan daha uzun dalgaboylarinda
olur. Çünkü triplet uyarilmis enerji seviyesi
genelde singlet uyarilmis enerji seviyesinden
daha düsük enerjilidir.
34
Uranil nitrat UO2 (NO3)2 çözeltisinin spektrumu
da örnek olarak verilebilir.Bunu için tuzun
1.10-4 M'lik bir çözeltisi hazirlanir ve
absorpsiyon spektrumu alinir.Bu spektrumdan
maddenin en çok absorpsiyon yaptigi dalga
boyu(250 nm)tespit edilir.Bundan sonra bu 250
nm'lik isinla(monokromatik)uranil nitrat
çözeltisi devamli olarak isinlanir.Yayinlanan
isinlar bir florometrede kayedilir.Böylece
maddenin emisyon spektrumu elde edilir. Sekilde
görüldügü gibi uranil nitrat 450 nm'den sonra
emisyon yapmaya baslar ve emisyon yaklasik 700
nm'ye kadar devam eder.Madde en siddetli emisyonu
515 nm de(yesil isin) yapar. Teorik olarak bir
maddenin uyarilma spektrumunun bittigi yerde
floresans spektrumu onun bittigi yerde de
fosforesans spektrumu baslar.
35
FLORESANS VE FOSFORESANS ÖLÇÜMÜ IÇIN CIHAZLAR
Numuneden gelen isin, önce floresans
uyaracak isinlari geçiren fakat floresans
emisyonunun dalga boyundaki isinlari disarida
tutan veya sinirlayan bir uyarilma filtresinden
veya bir monokromatörden geçer. Floresans
numuneden bütün yönlere dogru olur, fakat en
uygun sekilde floresans uyarma isinina dik açidan
gözlenir. Yayilan isin, ölçme için floresansi
ayiran ikinci bir filtreden veya monokromatörden
geçtikten sonra bir dedektöre ulasir. Referans
isin demeti ise, isigin gücünü yaklasik olarak
floresans isinlarinkine azaltan bir azalticidan
geçer . Referans ve numune fotoçogaltici
tüplerden gelen sinyaller, sonra çiktiyi bir
metreye veya kaydedici ile gösteren bir fark
yükselticisine gönderilir.
36
(No Transcript)
37
(No Transcript)
38
FLOROMETRE VE SPEKTROFLOROMETRELERIN BILESENLERI
ISIK KAYNAKLARI Lambalar Düsük
basinçli civa ark lambalari ve yüksek basinçli
ksenon ark lambalari kullanilir.Filtreli
Florometreler için erimis silika pencereli,düsük
basinçli civa buhar lambasi kullanilir.
LazerlerUyarma kaynagi olarak pulslu azot gazi
lazeri veya NdYAG lazeri ile pompalanan
ayarlanabilir boya lazerleri kullanilabilir.
39
FILTRE VE MONOKROMATÖRLER Hem
uyarma demetinin hem de olusan floresans isinin
dalga boyunun seçilmesi için,floremetrelerde
girisim ve absorpsiyon filtrelerinin her ikisi de
kullanilir.Spektroflorometrelerin çogu en az bir
bazen iki optik agli monokromatörle
donatilmistir.
40
DEDEKTÖRLER Tipik lüminesans
sinyali düsük siddetlidir,ölçülebilmeleri içim
yükseltilmeleri gerekir.Duyarli foloresans
cihazlarda fotoçogaltici tüpler en yagin
kullanilan transduserlerdir.
Spektroflorometreler için diyor-serili ve yük
aktarma dedektörleri önerilmektedir.Bunlar hem
uyarma hem de emisyon spektrumlarinin hizli
kaydina izin verir ve kromatografik ve
elektroforezde özellikle faydalidir.
41
HÜCRELER VE HÜCRE BÖLMELERI Floresans
ölçümleri için cam veya silisten yapilmis hem
silindirik hem de dikdörtgen prizmasi seklindeki
hücreler kullanilir. Cilt yaglari genellikle
floresans yaptigi için hücreler üzerindeki parmak
izinin önlenmesi ,absorbans ölçümlerinden daha
önemlidir.
42
CIHAZ TASARIMLARI

• Tipik Bir Fotometre

43
SPEKTROFLOROMETRI
44
FOSFORIMETRELER
Fosforesans çalismalari için kullanilan
cihazlar,tasarim bakimindan ilave iki bilesen
gerektirmesi disinda ,florometreler ve
spektroflorimetrelere benzerler.Fakli olarak
1-Sirayla numuneyi isiyacak ve uygun bir
geciktirmeden sonra fosforesans siddetini ölçecek
bir düzenktir. 2-Ayni numuneden
kaynaklanabilecek olan uzun ömürlü fosforesans
emisyonu ile kisa ömürlü fosforesans emisyonu
arasinda fark olusturmak için ,zaman gecikmesi
gereklidir. Mekanik hem de elektronik
cihazlar kullanilir ve birçok ticari cihazin
fosforesans ölçümleri için aksesuarlari
bulunmaktadir.
45
(No Transcript)
46
CIHAZIN AYARLANMASI Cihazlar
tekrarlanabilirlik bir duyarlilik seviyesine
ayarlanir.Ayarlama genellikle,kararli bir
floroforun bir standart çözeltisi ile
yapilir.Bunlara florofosfor maddeler denir.
Bu amaçla ,en yaygin kullanilan reaktif ,derisimi
yaklasik 10-5 M olan kinin sülfatin bir standart
çözeltisidir. (genellikle 350 nm'deki isinla
uyarilir ve 450 nm'de isin yayar.)
Salisilik asit de bu amaçla kullanilabilir.(308
nm dalga boyunda bir isinla uyarilirsa,o da 450
nm dalga boyunda,bir floresan isin demeti
verir.) Bu amaçla çok kullanilan bir
baska ayar maddesi de asetil salisilik
asittir(ASA).(Bu madde 278 nm dalga boyunda bir
isinla uyarilirsa 335 nm dalga boyunda siddetli
bir floresans isini verir.)
47
UYGULAMALAR ve FOTOLÜMINESANS YÖNTEMLERI
Floresans ve fosforesans yöntemleri
absorbansa dayali spektrofotometrik ölçümlerden
daha düsük derisim araliklarina uygulanabilir.
Floresans olusturan kompleks olusturarak
metal iyonlarinin emisyonu ölçülebilir.
Florometik analizin organik ve biyokimyasal
türlere çok sayida uygulamasi vardir.
Florometrenin en önemli uygulamalari, gida
ürünleri, ilaç, klinik numuneler ve dogal
ürünlerin analizidir. Fosforesans ve
floresans yöntemleri birbirlerini tamamlama
egilimindedirler.
48
Fosforimetri, nükleik asitler, amino
asitler pirin ve pirimidin, enzimler, petrol
hidrokarbonIari ve pestisitler gibi maddeleri de
kapsayan çok çesitli organik ve biyokimyasal
türlerin tayini için kullanilmistir.
Fosforimetri, florometri kadar yaygin kullanim
aIani bulmamistir. (Çünkü düsük sicakliklara
ihtiyaç duyulur ve fosforesans ölçmeleri daha
zayif kesinlige sahiptir.) Fosforesans
islemleri potansiyel olarak daha yüksek
seçiciligi sahiptir. (Davranistaki bu farkin
sebebi, etkili fosforesansin uyarilmis triplet
haldeki molekül sayisini artirmak için hizli
sistemler arasi geçise ihtiyaç duymasi,
dolayisiyla uyarilmis singlet derisimini ve
böylece de fosforesans siddetini azaltmasidir.)
49
INORGANIK TÜRLERIN FLOROMETRIK TAYINLERI
Inorganik florometrik yöntemler iki
tiptir 1-Dogrudan yöntemler floresans yapan bir
selat olusumunu ve onun emisyonunun ölçümünü
içerir. 2-Tayin edilecek maddenin söndürme
etkisiyle floresanstaki azalmaya dayanir. Ikinci
teknik anyon analizleri için yaygin olarak
kullanilir.
50
Katyon analizleri için en basarili florimetrik
reaktifler,metal iyonu ile selat olusturmayi
saglayan iki veya daha fazla elektron verici
fonksiyonel gruba sahip aromatik
yapilardir.Yaygin dört reaktifin yapisi asagida
verilmistir
51
Çizelge Inorganik Türler için seçilmis
Florimetrik Yöntemler
52
ORGANIK TÜRLERIN FLOROMETRIK TAYINLERI
Florimetrik analizin organik ve biyokimyasal
türlere çok sayida uygulmasi vardir.
Örnegin,Weissler ve White ,çok çesitli organik
bilesikler,enzimler ve koenzimler,tibbi maddeler
bitkisel ürünler ,steroider ve vitaminleri içeren
200'ün üzerindeki maddenin tayini için yöntemler
verilmistir. Florometrinin en önemli
uygulamalari,gida ürünleri,ilaç,klinik numuneler
ve dogal ürünlerin analizleri ile ilgilidir.
53
FLOROMETRI VE FOSFOROMETRININ SIVI
KROMATOGRAFISINDE DEDEKTÖR OLARAK
KULLANILMASI Fotolüminesans
ölçmeleri,kromatografik veya kapiler elekroforez
kolonlardan çikan bir numunenin bilesenlerinin
tespiti ve tayini için önemli bir yöntem saglar.
Bunlarin çogunda floresans,uyarici isina 90
derece yerlestirilmis bir fotoelektrik dedektör
yardimiyla gözlenmektedir.
54
KEMILÜMINESANS
A B ? C' C'
? C hv Burada,C' ,C türünün
uyarilmis halini göstermektedir.Bu olayda
lüminesans spektrumu ,reaksiyon ürünü C'in
spektrumudur. Kimyasal reaksiyon,temel haline
dönerken,isik yayan veya enerjisini daha sonra
emisyon yapan veya enerjisi daha sonra emisyon
yapacak baska türe aktaran ,elektronik olarak
uyarilmis bir tür verildigi zaman kemilüminesans
meydana gelir.Kemilüminesans reaksiyonlarina çok
sayida biyolojik sistemde rastlanir ve bu olaya
genellikle biyolüminesans adi verilir.Biyolüminesa
ns gösteren türler için örnekler ,ates böcegi
,deniz meneksesi ve bazi deniz anasi
bakteriler,tek hücreli hayvanlar ve kabuklu
hayvanlardir.
55
KEMILÜMINESANSIN ÖLÇÜLMESI
Kemilüminesans ölçmeleri için cihaz,oldukça
basittir ve sadece uygun bir reaksiyon kabi ve
bir fotoçogaltici tüpten ibaret olabilir.(Genel
olarak ,tek isin kaynagi ,analit ile reaktif
arasindaki kimyasal reaksiyon oldugundan ,dalga
boyu seçici cihaza gerek yoktur.)
Zamanin bir fonksiyonu olarak ,bir kemilüminesans
deneyinden elde edilen tipik sinyal ,reaktif ve
analitin karistirilmasi tamamlandiginda ,hizla en
yüksek degere ulasir,sonra sinyalin daha az veya
daha çok üstel bozunmasi takip eder.
56
Reaktifler karisitirildiktan sonra,zamanin bir
fonksiyonu olarak kemilüminesans emisyon siddeti
Kantitatif analiz için ekseriya sinyal
sabit bir zaman periyodu için inrtegre edilir ve
ayni yolla islem görmüs standartlar ile
karisilastirilirlar.Alternatif olarak,pik
yükseklikleri ile kullanilir.Sinyal ve derisim
arasinda ,genis bir derisim araliginda genellikle
dogrusal bir iliski vardir.
57
KEMILÜMINESANSIN ANALITIK UYGULAMALARI
Gazlarin Analizi Ozon,azot oksitler ve
kükürt bilesikleri gibi atmosferik kirleticilerin
tayini için yüksek duyarlilik ihtayaci sonucu gaz
bilesiklerinin tayini için kemilüminesans
yöntemleri ortaya çikmistir.Bu yöntemlerin en
yaygin kullanilanilanlarindan biri,azot monooksit
tayini için olanidirreaksiyon söyledir
NO O3 ? NO2 O2 NO2 ?
NO2 hv (? 600-2800)
58
Azot oksidin ozon ile reaksiyonu,azotun daha
yüksek oksitlerinin tayini için de
uygulanmistir.Örnegin otomobil egsoz gazindaki
azot dioksit içerigi,gazin bir çelik tüp
içerisinde 700 santigrat derecedde termal
bozunmasi ile tayin edilmistir.Reaksiyon
söyledir NO2
? NO O
Numuneler ,azotun kantitatif olarak
azotmonookside dönüstügü kosullar altinda oksijen
atmosferinde isitilarak parçalanirsonra olusan
azot monoksit ilgili yöntemle ölçülür.
Diger bir önemli kemilüminesans yöntemi
atmosferik ozonun izlenmesinde kullanilir.Bu
durumda,tayin,analit bir aktif silikajel yüzeye
absorbe olmus rodamin-B boyasi ile reaksiyona
girdigi zaman olusan lüminesansa dayanir.Bu islem
1 ppb'den daha az ozona duyarlidir,cavap 400
ppb'lik ozona kadar dogrusaldir.Ozon ,analit
edilenle reaksiyona girdigi zaman olusan
kemilüminesansa dayanilarak gaz fazinda da tayin
edilebilir.Her iki reaktifin de ozon için
spesifik oldugu belirtilmistir.
59
Baska önemli bir gaz kemilüminesans yöntemi
,hidrojen sülfür ,kükürt dioksit ve merkaptanlar
gibi atmosferik kükürt bilesenlerinin tayini için
kullanilmaktadir.Burada ,numune bir hidrojen
alevinden bir kükürt dimeri olusturmak üzere
yakilir.Dimer sonra isik emisyonu ile bozunur.
4H2 2SO2 ?S2 4 H2O
S2 ? S2 hv
Burada ,384 ve 394 nm'de pikleri olan mavi renkte
isin olusur.Isinin siddeti uyarilmis kükürt
dimerinin derisimi ile orantilidir.Benzer
sekilde,hidrojen alevinde fosfor bilesiklerinin
yanmasi da HPO'dan dolayi 526 nm'de emisyon
yapar. 104'lük bir derisim araliginda dogrusal
bir çalisma grafigi elde edildigi
belirtilmistir.Bu alev kemilüminesans
tekniklerinin her ikisi de ,gaz kromatografi
kolonlarindan çikan gazda kükürt ve fosfor
türlerinin tespiti için kullanilmistir
60
Sivi Fazda Inorganik Türlerin Analizi
Sivi fazda yürütülen analizlerin bir çogu ,
kemilüminesans gösteren organik maddelerden
faydalanilir.Bu reaktifler ,oksijenle ,hidrojen
peroksitle ve diger bir çok kuvvetli yükseltgen
maddelerle kemilüminesans yükseltgenme ürünü
vermek üzere reaksiyona girerler.Lüminol bu
bilesiklerin en yaygin örnegidir.Onun,kuvvetli
bazik ortamlarda oksijen,hidrojen peroksit
,hipoklorit iyonu ve permanganat iyonu gibi
kuvvetli yükseltgenlerle reaksiyonu asagida
verilmistir.Bu raksiyonun yeterli bir hizda
ilerlemesi için genellikle katalizöre ihtiyaç
duyulur.Olusan emisyon ,ürünün yani
3-aminoftalat anyonunun floresans spektrumuna
uyarkemilüminesans mavi olarak görülür ve
yaklasik 425 nm civarindadir.
61
Belirli sinirlar içinde lüminolun
kemilüminesans siddeti,yükseltgenin,katalizörün
ya da lüminol derisimi ile dogru
orantilidir.Sonuç olarak ,bu reaksiyon türlerin
herhangi birinin tayini için duyarli bir yöntem
verir.Örnegin,yükseltegen olarak hidrojen
peroksit kullanilarak Co2 katalizörü 0,01
nmol/L'ye , Cr3 ,0,5nmol/L'ye ve Cu2 ise 1
nmol/L'ye kadar olan derisimlerde tayin
edilebilir.Bazi katyonlar lüminesansi
azaltir,böyle durumlarda siddetteki azalma
derisim tayinin yapilmasini saglar.
62
Organik Türlerin Analizi Analitin
substrat oldugu ve ürünlerden birinin
kemilüminesansla tespit edildigi bir enzim
reaksiyonundan sonra bir kemilüminesans
basamaginin yürütülmesi yaygin bir uygulamadir.Bu
tutuklanmis enzim içeren kolonlu akis
sistemlerinde yaygin olarak kullanilir.Bununla
beraber ,son yillarda optik fiberlere tutturulmus
enzimlerin kullanildigi biyosensör tasarimlarina
önem verilmektedir. Ön tespit basamaginda
H2O2 olusturan oksidaz enzimleri yaygin olarak
kullanilmaktadir.Bir çok farkli kemilüminesans
sistemlerle sadece H2O2 tayin edilemez,bir çok
numunede ,özellikle sulu çözeltilerinde
halihazirda bulunan gerekli yükseltgen (O2'de
tayin edilebilir.Enzimin kantitatif olarak
dönüstügü düsünülerek,substratlar, H2O2'nin
tayin edilebildigi 10-100nM'a kadar tayin
edilebilir.Bu sekilde tayin edilen
substratlar,glukoz,kolestrol,kolin,ürik asit
,amino asitler,aldehitler ve laktati kapsar.
63
Ürik asit O2
üreaz allontoin H2O2 Bu
yaklasim,analiti tamamen esdeger miktardaki
kemilüminesans ürününe dönüstürmek için ard arda
enzim basamaklarinin kullanimiyle
geniletilebilir.Bu yolla,glikozdan baska
sekerler,glukozidler,kolestrol esterleri,kreatin
ve asetilkolin tayin edilmistir. Sakkaroz
H2O invertaz a -D-glukoz
Fruktoz a - D-glukoz
mutarotaz ß-D-glukoz ß-D-glukoz
O2 glukoz oksidaz
glukonik asit H2O2 H2O2 tayini
için lüminol ve bir peroksidaz katalizörü optimum
bir sistem olarak görülmektedir.Kemilüminesans
siddeti yaklasik 100 ms'de en yüksek olur,çözücü
suludur,fakat bazi organik bilesenlerle
uyumludur 103 veya 104 derisim araliginda
dogrusallik gösterir ve bu bölgede gözlenebilme
siniri 0,1 pM'dir
64
LABORATUAR ÇALISMALARI
KININ TAYINI(Florimetrik) Kinin floresans
özelligi çok büyük olan maddelerden birisidir.Bu
özelliginden yararlanilarak maddenin tayini
yapilabilir.Tonik sulardaki kinin asagidaki
metodla tayin edilebilir. Standart çözelti 445
nm'de çözeltilerin floresanslari ölçülür.Bunlarla
kalibrasyon grafigi çizilir.Ancak ölçme basit
florimetre ile yapiliyorsaprimer fitre olarak
LF2 ,sekonder filtre olarak da bir jelatin
kullanilir ve ölmeler ondan sonra yapilir.
Bundan sonra ml de 0,000025 ve 0,000045 mg kinin
ihtiva eden iki çözelti hazirlanir.Bunlarin
floresanslari ölçülür ve kalibrasyon grafiginde
konsantrasyonlari bilinmiyormus gibi tayin
edilir.
65
Tonik sulardaki kinin konsantrasyonu tayin
edilmek istenildiginde tonik suyun gazinin
uzaklastirilmasi gerekir.Bunun için numune bir
behere alinip 5-10 dakika siddetle
karistirilir.Bu sekilde gazi uzaklastrilan tonik
sudan 12,5 ml ,25 ml lik dereceli bir balona
alinir ve hacmi 0,1 M sülfürik asitle 25 ml ye
tamamlanir.Bu çözeltiden belirli hacimde kisimlar
alinarak 0,05 ml lik sülfürik asitle belirli
oranlarda seyreltilir ve floresanslari
ölçülür.Seyreltme tonik suyun floresansinin
kalibrasyon grafigi konsantrasyon araligina
girmesine kadar devam edilir.Tonik suyun bu
andaki floresansi ölçülür.Kalibrasyon grafigi
kullanilirak konsatrasyonu hesaplanir(Kontrol)
Hesaplamada daha önce konsatrasyonu belli
çözeltilerde(0,000025 ve 0,000045 mg/ml)hangi
oranda bir düsük veya hangi oranda bir fazla
deger bulunmussa tonik suyu konsantrasyonu tayin
edilirken de ayni oran kullanilmalidir.Örnegin
,kalibrasyon grafiginden 0,000025 mg/ml yerine
0,000027 mg/ml bulunmussa 0,000027/0,0000251,08
lik bir faktör bulunur.Bu faktör bulunan tonik
sudan bulunan konsatrasyonla çarpilir.Faktör
olarak örnegin 0,98 degeri bulunmusatonik suyun
konsantrasyonu 0,98 ile çarpilir.Bu çok önemli
bir islemdir unutulmamalidir.
66
ALÜMINYUM TAYINI Eriokrom mavi-siyah
RC'den yararlanilir.ReaksiyonpH'si 4,8 olan bir
tampon çözeltide gerçeklestirilir.Böyle bir
ortamda berilyum floresans vermez.Ortamda
demir,krom,nikel,kobalt ve bakir varsafloresansi
maskeler.Florür varsauzaklastirilmasi
gerekir.(alüminyumla çok saglam kompleks
verir)Içinde 10 ml amonyum asetat ,1 ml seyreltik
sülfürik asit ve 3 ml erikrom mavi-siyah RC
çözeltisi bulunan 100 ml'lik dereceli kaplara iyi
kalibre edilmis bir büretten (15,0),(20,0),(25,0),
(30,0),(35,0),(40,0) ve (45,0) ml standart
alüminyum çözeltileri ilave edilir.Bundan sonra
çözeltilerin pH'si 4,6 /- 0,2 ye ayarlanir ve
100 ml'ye tamamlanir.Çözeltiler 1 saat kendi
haline birakilir. Alüminyum konsatrasyonu
0,0045 mg/100 ml olan standart alinarak,çözeltiler
in floresans degerleri 590 nm de ölçülür.Primer
filtre olarak,genelde Corning 5543 veya
5874,sekonder filtre olarak da Corning 2408
kullanilabilir.(gerekliktigi halde)Ölçülen
floresans degerleriyle bir kalibrasyon grafigi
çizilir.Litresinde yaklasik 0,020 mg alüminyum
,ihtiva eden numunesinin konsatrasyonu tayin
edilir.
67
FLORESANS VE FOSFORESANS YÖNTEMLERI KULLANILMIS
ÇALISMA ÖRNEKLERI
1-Hücre içi serbest Ca2 ve Zn2 derisimlerinin
spektroflorometrik olarak ölçülmesi (DENEYSEL
D iYABET K KARD iYOM YOPAT iDE HÜCRE IÇI
SERBEST IYON DER ISIMI -Murat AYAZ/Doktora Tezi
-Ankara Üniversitesi-2004) Hücre içi
serbest Ca2 ve Zn2 ölçümleri için her iki
iyona da duyarli bir floresans boya olan fura 2
kullanilmistir. Gözlenen Ca2 derisimine ait
sinyallerin ölçümü PTI (Photon Technology
Internetional) RatioMaster marka
mikrospektroflorimetre ile yapilarak Felix (PTI)
programi ile bilgisayara kaydedilip
degerlendirilmistir.
68
Sekil Zn2 için hücre içi minimum ve
maksimum floresans oranlarinin belirlenmesiMaksim
um Zn2i için ZnPt (1 µM), minimum degeri
için ise TPEN (30 µM) kullanilarak alinmistir.
Oklar kimyasallarin uygulama noktalarini temsil
etmek için kullanilmistir.
69
2-Tabletlerde Mebendazolün Spektroflorimetrik
Tayini (GÜ, Gazi Egitim Fakültesi Dergisi, Cilt
24, Sayi 3 (2004) 159-174) Bu çalismada,
tabletlerde mebendazol (MBZ) ilaç etken
maddesinin tayini için spektroflorimetrik bir
yöntem gelistirilmistir. Bu amaçla, mebendazol
ilaç etken maddesinin çesitli çözücülerde
floresans spektrumlari alinarak en uygun
çözücünün dimetil sülfoksit ve bu çözücü
ortaminda uyarma (?uy) ve emisyon (?em) dalga
boylarinin sirasiyla 390 nm ve 473,6 nm oldugu
belirlenmistir. Kalibrasyon grafikleri çizilmis
ve bunlarin 0-2,5 mg/L derisim araliginda
dogrusal oldugu görülmüstür. Dogrudan kalibrasyon
grafiklerinden ve standart katma yöntemiyle
Vermazol tabletindeki mebendazol miktari ayin
edilmistir.
70
Kalibrasyon egrileri ile Ölçüm Mebendazol için
kalibrasyon egrileri 0,295 - 2,95 mg/L derisim
araliginda çizilmistir. Bu amaçla DMF ve DMSO
çözücüleri kullanilarak Stok mebendazol
çözeltilerinden bir seri çözeltiler hazirlanmis
ve en uygun uyarma ve emisyon dalga boylarinda
floresans siddetleri kaydedilmistir. Mebendazol
derisimine karsi floresans siddetleri grafige
geçirilerek kalibrasyon egrileri elde edilmistir.

71
Standart Katma Yöntemi Kullanarak Tabletteki
Mebendazol Miktari TayiniDMSO ortaminda
Vermazoldeki mebendazolün standart katma yöntemi
ile tayini için 5adet 25,0 mL'lik ölçülü balona
6,0'sar mL Vermazol kullanilarak hazirlanan
DMSOliçözelti konmustur. Bu ölçülü balonlara
stok mebendazol çözeltisinden sirasiyla 0,0 2,0
4,06,0 ve 8,0 mL ilave edildi ve hacimleri DMSO
ile 25,0 mL'ye tamamlanmistir. Her bir çözeltinin
uygun uyarma ve emisyon dalga boylarinda
floresans siddetleri kaydedilerekkatilan
standartlarin derisimine karsi grafige
geçirilmis. Çizilen dogrunun derisim eksenini
kestigi noktadan yararlanarak tabletlerdeki
mebendazol miktarlari hesaplanmistir.
72
Dimetil sülfoksit ortaminda ortaminda ?uy 390 nm
uyarma dalga boyundaki floresans spektrumlari
(a) çözücü, (b) standart mebendazol çözeltisi,
(c) vermazol tablet ve (d) katki maddeleri.
73
Sulu çözeltideki 9,10-phenanthrenequinone'nin
fosforesansi üzerine çözücü ve sicaklik
etkisi (Rosaly S. Silva , David E. Nicodem
,Journal of Photochemistry and Photobiology A
Chemistry 162 (2004) 231238)
74
Sicaklik sabit çözünün etkisi incelenmistir.MeCN
spektrumu arttirmistir.Burada çözünücün
fosforesans spektrumuna etkisi gösterilmeye
çalisilmistir.Düsük sicaklikta daha ayrintili
pikler görülebilmistir.Sicaklik arttiça kuantum
verimi azaldigi için böyle bir durum gözlenir.
75
KOLLODIAL ORTAMDA KUMARIN-120'NIN FLORESANS
ENERJI TRANSFERININ INCELENMESI(Murat ACAR
,Yüksek Lisans Tezi ,Prof. Dr. Yavuz ONGANER
Floresansa F K'(Io-I) esitligine göre
dogru orantilidir.Düsük konsantrasyonda
linnerdir.Bu çalismada bu durum
gösterilmistir.
76
(No Transcript)
77
Kaynaklar
1-Enstrümental Analiz IlkeleriSKOOG-HOLLER-NIEMAN
,Bilim Yayincilik,1997. 2-Instrumental
Analiz,Prof.Dr.Turgut Gündüz,Gazi
Kitapevi,9.Baski,2005. 3-Enstrümental
Analiz,Prof.Dr.Atilla Yildiz,Prof.Dr.Ömer
Genç,Hacettepe Üniversitesi Yayinlari,A-64,1993.
4- DENEYSEL D IHÜCRE IÇI IDERISII-AYAZ/Doktora
Tezi -Ankara Üniversitesi-2004. 5-Tabletlerde
Mebendazolün Spektroflorimetrik Tayini,Ü, Gazi
EgFakültesi Dergisi, Cilt 24, Sayi 3 (2004)
159-174. 6-Sulu çözeltideki 9,10-phenanthrenequin
one'nin fosforesansi üzerine çözücü ve sicaklik
etkisi,S. Silva , David E. Nicodem ,Journal of
Photochemistry and Photobiology A Chemistry 162
(2004) 231238. 7-KOLLODIORTAMDA
KUMARI'NIFLORESANS ENERJI INIII,ACAR ,Yüksek
Lisans Tezi ,. Dr. Yavuz ONGANER,2007.