Slayt 1

1
Viral Hepatitlerde Dendritik
Hücre Bazli Tedaviler
Prof.Dr.Ercüment Ovali KTÜ-Ati
Teknoloji Proje sorumlusu
2

• Günümüzde viral ve maling hastaliklarin
  tedavisinde çok önemli gelismeler olmasina
  ragmen,
• Mevcut tedavilerin yeterli oldugunu söylemek
  mümkün degildir

3

• Bu durumda farkli tedavi seçeneklerine
  gereksinim vardir
• Bu seçeneklerden biri immünoterapi
  uygulamalaridir.

4

• Kullanilan immünoterapi rejimlerinden biride
• DENDRITIK HÜCRE
• bazli uygulamalardir.

5

• Dentritik hücreler profesyonel antijen sunan
  hücrelerdir(ASH).
• ASH içinde kendisine en yakin rakibinden 100 kat
  daha güçlü bir sekildeT lenfositleri
  uyarabilmektedirler .

6
DHnin Öyküsü

• 19. yüzyilada Paul Langerhans LHni tanimladi
• 1973de Stainman bu hücreler için DH tanimini
  kullandi
• 1990li yillarda DH kök hücreden ve monositlerden
  üretilmeye baslandi
• 2000 yilidan sonra ilk klinik çalismalar basladi

7
DHnin kaynagi

• DHler heterojen bir grup hücre olup kemik
  iliginden Degisik büyüme faktörlerinin(flt3-l,
  GM-CSF vb) varliginda olusurlar.
• Periferik kanda ise DHler HLA-DR pozitif olup
  CD11c ve CD123 varligina göre iki ayri gruba
  ayrilirlar
• Myeloit DH CD 11c pozitif CD123 negatif
  (DC1)
• Plazmasitoit DHCD11c negatif CD123 pozitif(DC2).
  
• Yung JW. ASH Education program book. San
  Francisco, California December 1-5. p361-366
  2000
• Osada T et al. Rev. Immunol. 25377-4132006

8
Morfolojik Karakterleri

• Isimlerinin tanimladigi gibi tüyümsü çikintilari
  olan , oval çekirdekli iyi gelismis ERye sahip
  hücrelerdir.
• Plazmastoit tipi ise plazma hücresine benzer

9
Fonksiyonel Karakterleri

• 3 farkli fonksiyonel karaktere sahiptirler
• T hücre uyarimi
• Immün toleransin indüklenmesi
• B hücre fonksiyonlarinin düzenlenmesi

10
Dendritik Hücre Bazli tedaviler

• Bir çok olguda immün sistem tümörü/viral yükü
  eradike edemez. Buda tümörün yayilmasi ile
  sonuçlanir. Çünkü

11

• Tümör Immün Kontrolden saklanmaktadir.
• A-Tümörün gizlenmesi
• 1- Costimulatuar molekül ekspresyonunu
  azaltirlar2- MHC I ve II eksp. azaltir.3-
  Target antijen genlerini baskilarlar
• B-Immün supresyon indüksiyonu
• 1- IL-10 sekresyonunu artirirlar
  Th3tip yanit(Treg)2- TGF beta sekresyonunu
  artirirlar
• 3- Solubil ihibitörleri artirirlar)(iNOS,ARG-1).
  4- Fas-L salgisini artirirlar.5- Hizli
  proliferasyonla toleransi indüklerler

12
Viral yükün eradike edilememe nedenleri

• Yetersiz immün yanit(özellikle akut fazin
  semptomatik geçtigi hastalarda viral yük daha
  yüksek olmaktadir) (Thimme et al., 2001)
• T lenfosit epitoplarinda mutasyonlar (Erickson et
  al., 2001 Weiner et al., 1995)
• Viral proteinlerle immün yanitin baskilanmasi
  (Gale et al., 1997 Keskinen et al.,
  2002Kittlesen et al., 2000).
• APC, Hücresel yanitin bozuk olmasi (Cooper et
  al., 1999 Thimme et al., 2002)

13

• DH ise klas I ,II ve costimülatuar moleküller
  yüksek oranda tasir.
• Ve istenirse Th1 ve/veya Th2 yaniti
  indükleyebilir

14
DHlerin elde edilmesi

• Üretim
• Izolasyon

15
Üretim

• CD 34 kök hücrelerden DH Üretimi
• Flt3L, IL-3 and IL-6, ile 14 günlük bir
  inkübasyon sonrasi
• IL-4 and GM-CSF 3 günlük yeni besleme
  süreci
• Monositlerden DH üretimi
• En popüler olan bu metot da hücreler IL-4,
  GM-CSF ile 7 gün inkübe edilirler.
• Neoplastik Hücrelerden DH üretimi
• Neoplastic DHler ALL,AML,KML hücrelerinden
  GM-CSF, IL-4, TNF-a ve CD 40L varliginda
  üretilebilmektedir.
• Osada T, et al.Inter Rev Immunol
  200625377413)
• Curti A, et al.J Immunol.2001166848854.
• Ovali E,et al.Haematologica.2000 85464469

16
DH Izolasyonu

• Periferik kanda 3 x 106 to 17 x106/litre
• Lokoferezis ile 1 x106 to 10 x106 toplanabilir
• Ancak yeterli olmadigindan G-CSF,GM-CSF,progenipoe
  tin bu amaçla kullanilabilir
• Osada T, et al.Inter Rev Immunol
  200625377413)
• Pullarkat V, et al.Clin Cancer Res.2003
  913011312
• Lonial S, et al.Biol Blood Marrow Transplant
  2004 10848857

17
Kültür özellikleri

• Baslangiçta fetal calf serum (FCS) kullanilmis
  yasanan sorunlar nedeniyle otolog seruma(OS)
  dönülmüstür.
• Ancak hasta serumlarinin IL-10, TGF-ß gibi
  solubil inhibitörleri barindirmalari olasidir
• Bu nedenle serum free media kullanimi
  önerilmektedir.
• Osada T, et al.Inter Rev Immunol 200625377413)

18
Yüklemede Kullanilan Antijenler

• Tanimlanmis antijenlerPeptitler, proteinler,
  cDNA,
• Tanimlanmamis antijenler Tumor hücreleri, tumor
  lysates, heat-shock proteins, tumor / DC fusions
  and mRNAs, Inaktive Virüsler.
• Yardimci epitoplarKeyhold limpet haemocyanin
  (KLH), tuberculosis purified protein derivate
  (PPD), Pan-HLA-DR binding protein (PADRE)
• Osada T, et al.Inter Rev Immunol
  200625377413)
• Schnurr M, et al.Cancer Res 2001 6164456450
• Wierecky J, Cancer Res 2006 6659105918.
• Ovali E, et al.J Exp Clin Cancer Res 2007
  26209214

19
DH Maturasyonu

• Asilar için mutlaka matür DH ler kullanilmalidir.
• TNFa, IL1ß, IL-6 ve PGE2 standart maturasyon
  reagentlaridir. Ama???
• Hepatocyte growth factor (HGF)Hem CD34 pozitif
  hücrelerden hemde monositlerden olusan DH lerin
  maturasyonunda katkida bulunabilmektedir.
• Schuler-Thurner B, et al. J Exp Med
  200219512791288
• Ovali E,et al.Haematologica.2000 85464469
• McIlroy D, Gregoire M Cancer Immunol Immunother
  2003 52583591
• Sonmez M, et al.Saudi Med J 2007 28688695
• Ovali E, et al.J Exp Clin Cancer Res 2007
  26209214

20
Otoriteler
Asgari sart
Islem
- Kemik iligi nakli
- Kan, KI, GKK hemopoietik kök hücre - Hücre tedavileri için hücrelere yapilacak her türlü islem Kan bankaciligi, Tüp bebek uygulamalari, Immunoterapi uygulamalari Diger hücre tedavi ürünleri - Gen tedavi ürünleri
Aseptik teknikler yeterli
Çok
21
Release Tests of DCs based vaccine products
(Hinz T,et al. J Immunother 200629472476,Brent
M.Annual Somatic Cell Therapy Symposium,
9/25-27/2006. Osada T, et al.Inter Rev Immunol
200625377413)
Purity(as measured by flow cytometry) gt50 HLA DR , CD86, CD 11c/CD 123 positive Viability gt 70 by trypan blue exclusion or Propidium iodide stain Sterilty Bacteria, fungus, mycoplasma negative Pyrogenitiy Endotoxin negative by LAL Differentiation/Maturation(optional) Linage negative and CD80, CD83 positive (as measured by flow cytometry). Potency testings( To be developed and defined by product manufacturer) High level of target protein expression (Threshold is yet to be determined) CD45 positivity Mixed lymphocyte reaction Costim assay . Stability assay To be defined by product manufacturer. Functional assays (Late phase clinical development) Delayed type hypersensitivity reaction(DTH) ELISPOT Tetramer staining by flow cytometry
22
DH Bazli Asi Uygulamasi

• Optimal doz ve uygulama sikligi
• Bilinmemektedir.
• Önerilen ilk dozlarin 15 günde bir olmasidir
• En az 5 milyon hücre önerilmekte olup ilk veriler
  20 Milyon hücrenin optimal olacagini isaret
  etmektedir
• Uzamis uygulamalarin etkinligi artiracagi
  gösterilmistir
• Uygulama sekli
• SC,ID,IN uygulamalar T hücre uyarimi için
• IV uygulamalar ise B hücreleri uyarmak için
  tercih edilmektedir
• Ovali E, et al.J Exp Clin Cancer Res 2007
  26209214
• Osada T, et al.Inter Rev Immunol 200625377413

23
Yapilan Arastirmalar

• Bugün degisik türdeki kanser asilarinin
  tamamlanmis 7 adet Faz III çalismasi vardir
• Ancak DH asilari ile ilgili 100den fazla faz I/II
  bir adette Faz III çalisma mevcuttur. Hepsinin
  ortak sonucu
• Kanser asilari emniyetli bir uygulamadir. Dünya
  literatüründe bir çalismada Grade III toksite
  rapor edilmis diger tüm çalismalarda sadece Grade
  I toksite rapor edilmektedir
• Objektif klinik cevap oranlari 2.6-32 arasinda
  rapor edilmektedir.
• Freda K. Stevenson Curr Opin Oncol
  17573577.2005

24
Faz III Çalismalar

• Doehn Ch, Richter A, Lehmacher W, Jocham D.
• Adjuvant autologous tumour cell-lysate vaccine
  versus no adjuvant treatment in patients with M0
  renal cell carcinoma after radical nephrectomy
  3-year interim analysis of a German multicentre
  phase-III trial.Folia Biol (Praha).
  200349(2)69-73.
• Schadendorf D, Ugurel S, Schuler-Thurner B,
  Nestle FO, DC study group of the DeCOG.
  Dacarbazine (DTIC) versus vaccination with
  autologous peptide-pulsed dendritic cells (DC) in
  first-line treatment of patients with metastatic
  melanoma a randomized phase III trial of the DC
  study group of the DeCOG.Ann Oncol. 2006
  Apr17(4)563-70. Epub 2006 Jan 17.
• Hanna MG Jr, Hoover HC Jr, Vermorken JB, Harris
  JE, Pinedo et al,
• Adjuvant active specific immunotherapy of stage
  II and stage III colon cancer with an autologous
  tumor cell vaccine first randomized phase III
  trials show promise. Vaccine. 2001 Mar
  2119(17-19)2576-82.
• Jocham D, Richter A, Hoffmann L, Iwig K,
  Fahlenkamp D, et al.
• Adjuvant autologous renal tumour cell vaccine
  and risk of tumour progression in patients with
  renal-cell carcinoma after radical
  nephrectomyPhase III, Randomised controlled
  trial.Lancet.
• 2004363(9409)594-9.

25

• No authors listed
• Phase III randomized study of autologous
  lymphoma-derived idiotype specific vaccination
  plus GM-CSF in patients with follicular lymphoma
  in first complete remission.Clin Adv Hematol
  Oncol. 2003 Jan1(1)67.
• O'Brien ME, Anderson H, Kaukel E, O'Byrne K,
  Pawlicki M, Von Pawel J, Reck M SR-ON-12 Study
  Group.
• SRL172 (killed Mycobacterium vaccae) in
  addition to standard chemotherapy improves
  quality of life without affecting survival, in
  patients with advanced non-small-cell lung
  cancer phase III results.Ann Oncol. 2004
  Jun15(6)906-14.
• Wallack MK, Sivanandham M, Ditaranto K, Shaw P,
  Balch CM, Urist MM, Bland KI, Murray D, Robinson
  WA, Flaherty L, Richards JM, Rosen L, Bartolucci
  AA. Increased survival of patients treated with a
  vaccinia melanoma oncolysate vaccine second
  interim analysis of data from a phase III,
  multi-institutional trial.Ann Surg. 1997
  Aug226(2)198-206.

26
(No Transcript)
27
(No Transcript)
28
Vaccine protocol
Vaccine protocol
29
(No Transcript)
30

• Enfeksiyon - DH tedavisi

?
31
DHlerin mikroorganizmalara karsi konak
savunmasini güçlendirme veya kronik
tabiatli (HIV, HBV, HCV, papilloma, CMV
gibi) mevcut bir enfeksiyonun tedavisinde
kullanilabilir mi?
32
Ilk DH asisi örnegi spiroketlere karsi
uygulanmis B. burgdorferi yüklenmis DHler
farelerde spesifik koruyucu bagisik yanit
olusturmustur (Mbow et al. 1997) LCMV
peptid-yüklü DHler Farelerde çok kisa bir
sürede (2 gün) güçlü ve uzun (gt60 gün) süreli bir
antiviral yanit olusturmustur (Ludewig ve ark.
(1998) influenza (Lopez et al. 2000) ve HSV-2
proteinleri ile yüklenmis DH asilarinin (Schon et
al. 2001) spesifik T hücre ve koruyucu yanit
olusturduklari gösterilmistir.
33
Andriew JM ve ark. Nat Med 2003

• SIV yüklü DH ile asilanan 10 maymundan 7sinde
  Plazma viral yük 1000 kat azalmis.
• Etkinlik 1 seneden uzun sürmüs.

34
Andriev JM ve ark-Nature. 2004

• 18 ART tedavisi almayan hastaya HIV-1 yüklü DH
  asisi uygulamis 1 yil sonra 8inde viral yükün
  90nin altina inmis oldugu 4de ise 1000
  kopya/100mikrolitre oldugu saptanmis

-180 0 90
180 360
35
kronik HIV enfeksiyonunda DH asisi
insanlarda emniyetli bulunmus, çogu hastada
güçlü bir T hücre yaniti ve viral yükte düsüs
saglamistir (Lu et al. 2004). Iki farkli grup
tarafindan biri HIVgag peptidleri ile digerinde
III virus yüklenerek hazirlanmis DHler, HAART
tedavisi altindaki hastalara uygulanmis asilarini
n iyi tolere edildigi belirtilmistir (Garcia et
al. 2005Ide et al. 2006).
HIVgag peptid yüklü DH asisi, HAART kullanilan
hastalarda viral reboundu baskilamada yetersiz
kalsa da spesifik yanit olusturdugu, III virus/DH
çalismasinda ise spesifik hücresel yanitin zayif
ve geçici oldugu bildirilmistir. HIV-1gag, env
ve pol peptid yüklü DH asisi HIV-1
hastalarda iyi tolere edildigi ve ayrica kisa
sürede HIV spesifik IFNg lenfosit yaniti
olusturmustur (Connoly et al. 2007)
36
HCV enfeksiyonunda, HCV proteinleri ile
yüklenmis DH asilar kullanarak HCV spesifik
hücresel yanit olusturulabilecegi ileri
sürülmektedir Örnegin rHCV core protein ve
peptidleri ile yüklenmis DHlerle güçlü bir
humoral ve hücresel yanit elde edilmis (Encke et
al. 2005) bir diger çalismada, HCV NS3 protein
geni tasiyan adenovirus ile transfekte
DHlerin farkli fare türlerinde CD4 Th1 ve CD8 T
hücre yaniti olusturuldugu gösterilmistir
(Zabelata et al.2007).
37
Kronik HBV enfeksiyonunda, HBsAg-yüklü DH
asisinin saglikli gönüllülerde güvenli
oldugu, bazi deneklerde anti-HBs olusturdugu
(Akbar 2004). Kronik HBV hastalarinda HBsAg-yüklü
DH asisinin HBV replikasyonunu
baskiladigi, serum viral yükü azaltdigi, HBe-Agni
n kayboldugu ve anti-HBe gelistigi (Chen et al.
2005). Kronik HBVde yetersiz DH
aktivitesinin, HBcAg ve HBsAg-DH asisi ile
yeniden kazandirilabilecegi T lenfosit
proliferasyon ve antijen spesifik IFNg üretiminin
artirilabildigi bildirilmistir (Duan et al.
2006).
HBV-HCC hasta DHleri HBcAg ve HBsAg ile
yüklendiklerine güçlü bir CD40, 80 ve 86 sentezi
sagladiklari, T hücre proliferasyon ve IFNg
salinisini güçlü bir sekilde uyardiklari DH
asisinin HBV HCC hastalari için yeni bir tedavi
yöntemi olabilecegi bildirilmektedir (Shi et al.
2006).
38
Akbar ve ark. Journal of Hepatology 2007

• HB asisina cevapsiz 6 hastada HBsAg ve HBcAg
  yüklü DH asilamasi ile 28 gün sonra güçlü
  serokonverisyon elde edilmis

39
DH asi yönteminin C.trachomatis M.
tuberculosis parazit ve mantar enfeksiyon
modellerinde basarili bir sekilde uygulandigi
bildirilmektedir.
40
Sonuç DH asi yönteminin daha çok kanser alaninda
potansiyeli arastirilmakta, yüzlerce çalisma
yürütülmektedir. Diger taraftan, DHlerin
enfeksiyon hastaliklarindaki rolünün daha da iyi
anlasilmasina paralel olarak, deneysel/klinik
sartlarda Ag-yüklü DH asilarinin özellikle kronik
viral enfeksiyonlar için de hizla
degerlendirildigini görmekteyiz. 100 hastalik
AT2 ile inaktive HIV-1 yüklü DH asilamasi ile
ilgili faz III çalisma 2007 sonunda baslamistir.
41
Kanserde tartisilan DH asi yöntemi
sorunlarinin enfeksiyon hastaliklari için
de geçerli oldugu düsünülmektedir. en uygun DH
kaynaginin seçimi, en uygun antijenlerin
belirlenmesi ve uygun sekilde DHlere
yüklemesi, antijen yüklü DHlerin en uygun
sekilde, hangi sayida ve hangi yoldan enjekte
edilmesi gibi temel konularin kapsamli bir
sekilde çalisilmasina ihtiyaç vardir.
deneysel çalismalarda sorun teskil etmemekle
beraber, klinik uygulamalar için DHlerin yasal
mevzuat geregi GMP sartlarinda hazirlanmis
olmalari geregi de unutulmamalidir.
42
(No Transcript)