Presentazione di PowerPoint

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I recettori a sette domini transmembrana
Alcuni argomenti trattati sono disponibili in
formato PowerPoint al seguente indirizzo
web www.unipv.it/tslmra22
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Forme di Signaling Cellulare
(A) ENDOCRINO
(B) PARACRINO
cellula endocrina
recettore
cellula segnalatrice
ormone
cellule bersaglio
mediatore locale
Flusso sanguigno
cellula bersaglio
(C) NEUROCRINO
(D) CONTATTO-DIPENDENTE
cellula segnalatrice
cellula bersaglio
sinapsi
neurone
assone
cellula bersaglio
corpo cellulare
neurotrasmetttore
messaggero legato alla membrana
(A) Gli ormoni prodotti dalle ghiandole endocrine
sono secreti nel flusso sanguigno e possono
essere distribuiti allintero organismo. (B) I
messaggeri paracrini sono rilasciati dalle
cellule nel mezzo extracellulare e possono
diffondere e agire localmente. (C) I segnali
nervosi sono trasmessi lungo gli assoni a cellule
bersaglio remote. (D) Il signaling
contatto-dipendente richiede che le cellule siano
a contatto luna con laltra membrana contro
membrana. Le differenze cruciali tra le varie
modalità riguardano la velocità e la selettività
con cui I segnali sono trasmessi alle cellule
bersaglio.
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Trasduzione del Segnale da Recettori di Superfice
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Signalling mediante recettori accoppiati a
proteine G
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Regioni Idrofobiche e idrofiliche dei lipidi di
membrana
Lipide di membrana Idrofobico
Idrofilico Anfipatico
Glicerofosfolipide Sfingomielina Glicosfingolipide
Colesterolo
Diacilglicerolo Ceramide Ceramide Anelli
idrocarburici
Alcool fosforilato Fosforilcolina Residui
glucidici Gruppo OH di C3
Glicerofosfolipide Glicosfingolipide Colesterolo
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Lipidi di Membrana semplice organizzazione di
molecole anfipatiche
idrofilico
idrofobico
Lipidi di Membrana Sezione di un bilayer di
glicerofosfolipidi
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Tutte le membrane biologiche sono bilayers
lipidici Le proteine conferiscono proprietà
uniche a ciascun tipo di membrana
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Proteine Acilate e Prenilate
Acido palmitico
acido grasso legato mediante legame estere a una
Cys aggiunto in fase post-traslazionale
Esempi recettore per linsulina recettore
beta-adrenergico rodopsina
Acido miristico
acido grasso legato mediante legame amidico a una
Gly aggiunto in fase co-traslazionale
Esempio subunutà a di proteina G (membrana
plasmatica)
Isoprenoide (farnesilgeranilgeranil)
Isoprenoide legato mediante legame tioetere a una
Cys vicina allestremità C-terminale aggiunto in
fase post-traslazionale
Esempio subunutà g di proteina G (membrana
plasmatica)
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Recettori accoppiati a proteine G (GPCR)
I Recettori Accoppiati a Proteine G (GPCR)
rappresentano una famiglia di gt 1000 membri
strutturalmente correlati. Queste proteine sono
anche chiamate Recettori a 7 Domini Transmembrana.
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Recettori Accoppiati a Proteine G
1. Hanno tutti 7 domini transmembrana (ad
es. rodopsina) 2. Ci sono circa 1000 GPCRs nel
genoma. (di molti di essi non si conosce
ancora il ligando) 3. I singoli recettori
rispondono a un neurotrasmettitore come la
serotonina o la dopamina, una piccola
proteina (8-40 amminoacidi, un peptide) come le
endorfine uno stimolo olfattorio la
luce, nellocchio
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Struttura Generale dei Recettori a 7 DT
Caratteristiche generali dei GPCRs comprendono
domini transmembrana ad a-elica, ancoraggio ai
lipidi che ne stabilizza la conformazione, siti
di fosforilazione citosolici che ne regolano
lattività, e siti di glicosilazione
extracellulare che permettono linterazione con
molecole extracellulari e altre cellule.
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La Rodopsina è stato il primo membro della
famiglia dei recettori a 7 DT ad avere la sua
struttura determinata mediante cristallografia ai
raggi-x
PDB 1F88
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Varie proteine interagiscono con I GPCR o
Recettori a 7-DT per modularne lattività
Gli effetti di queste interazioni includono
alterata affinità per il ligando, dimerizzazione
del recettore che può aumentarne o alterarne
lattività, alterata localizzazione del
recettore, ecc.
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RUOLO DELLA b-ARRESTINA NELLA REGOLAZIONE DEI
RECETTORI ACCOPPIATI A G-PROTEINE
legame del messaggero
fosforilazione del recettore
interazione con b-ARR
associazione con CLATRINA
Formaazione della vescicola
endocitosi
1.     Dopo un certo tempo che si è stabilito il
legame dellagonista al GPCR, una kinasi (GRK)
fosforila alcuni residui aminoacidici
intracellulari del recettore 2.     La
fosforilazione porta a un disaccoppiamento del
GPCR dalla G proteina (desensitizzazione) e al
reclutamento della b-arrestina 3.     La
b-arrestina a sua volta recluta molecole di
clatrina 4.     Le molecole di clatrina
favoriscono la formazione di una cavità da cui
originerà la vescicola 5.     La successiva
endocitosi della vescicola provocherà
linternalizzazione del recettore.
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Le Proprietà dellInternalizzazione definiscono
due classi di GPCRs. Nel caso dei recettori di
classe A (b2-Adre), linterazione
b-arrestinaGPCR è transitoria, e la b-arrestina
non si localizza con i GPCR negli endosomi. Per i
recettori di classe B (Vaso2), linterazione
b-arrestinaGPCR è più stabile, e recettore e
barrestina co-localizzano negli endosomi.
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Traffico Cellulare della ?arr2-GFP con i
Recettori ?2AR (adre) e V2R (vasopr)
adren

• Assenza di agonista, la ?arr2-GFP era
  omogeneamente distribuita nel citoplasma delle
  cellule che esprimevano ?2AR o V2R. (0 min)
• Aggiunta di agonista, viene promossa la rapida
  redistribuzione dal citosol alla membrana
  plasmatica. (2 min)
• Una esposizione piu prolungata all agonista
  produceva una marcata differenza nel traffico
  della ?arr2-GFP (15 min)
• ?2AR rimaneva nella membrana plasmatica (A)
• V2R nellarco di 2-3 min, finisce
  nellevescicole endocitotiche (B)

vasopr

• Cellule HEK-293
• ? Co-transfettate con un plasmide contenente il
  cDNA per ?arr2-GFP e il cDNA per ciscun recettore
• Per visualizzare la ?arr2-GFP fluorescente in
  cellule prima e dopo il trattamento con agonista
  (10?M Isoproterenol, 100nM AVP)

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Colocalizzazione della ?arr2-GFP con i Recettori
?2AR e V2R internalizzati
adren

• I recettori ?2AR e V2R reclutano ?arrestin con un
  meccanismo comune durante le fasi iniziali, ma
  poi cè divergenza. Il complesso ?arrestin- ?2AR
  si dissocia a livello della membrana.
  ?arrestin-V2AR viene intenalizzato in vescicole
  endocitotiche.

vasopr

• Cellule HEK-293
• ? Co-transfettate con ?arr2-GFP e ciascun
  recettore
• Pre-marcate con rodamina-conj. Anticorpo
• che marca I recettori
• trattate per 15 min a 37?C con lagonista (10?M
• Isoproterenol, 100nM AVP)
• visualizzazione al confocale del recettore
  (rosso) e
• della ?arr2-GFP (verde) nelle stesse cellule.
• Colocalizzazione (giallo) del recettore con
  la ?arr2-GFP

• V2R estesa colocalizzazione
• ?2AR nessuna colocalizzazione

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Recettori accoppiati a proteine G