Tassonomia del genere Mycobacterium

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Tassonomia del genere Mycobacterium

• Enrico Tortoli
• Centro Regionale di Riferimento
• per i Micobatteri
• Firenze

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Le pietre miliari della tassonomia

• Adamo è autorizzato da Dio a dare un nome a tutti
  gli esseri viventi (Genesi 2.19)
• 4o secolo a.C., Aristotele si cimenta nella
  differenziazione di piante ed animali
• 1o secolo d.C., Plinio il vecchio dedica 4 libri
  della Naturalis historia alla zoologia, e 8 alla
  botanica
• 18o secolo Linneo introduce il sistema binomio

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Pietre miliari nella tassonomia dei micobatteri

• 1896 Lehmann e Neuemann descrivono
• Il genere Mycobacterium
• M. leprae
• M. tuberculosis
• 1899 descrizione di
• M. smegmatis
• M. phlei
• 1901 descrizione di M. avium
• 1923 descrizione di
• M. paratuberculosis
• M. chelonae
• 1926 descrizione di M. marinum
• 1938 descrizione di M. fortuitum

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Pietre miliari nella tassonomia dei micobatteri

• 1967 L. Wayne fonda lo IWGMT
• Analisi dei caratteri fenotipici
• Tassonomia numerica
• Studi cooperativi
• 1987 lo IWGMT riconosce il valore degli studi
  basati sullomologia del DNA
• Ceppi con omologia gt70 appartengono alla stessa
  specie
• 1990 E. Böttger adotta, per primo, il
  sequenziamento genico per lanalisi della
  tassonomia del genere Mycobacterium

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Classificazione

• regno Bacteria
• tipo Actinobacteria
• classe Actibobacteridae
• ordine Actinomycetales
• famiglia Corynebacteriaceae
• - genere Mycobacterium

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I complessi

• M. tuberculosis complex
• M. avium complex
• M. terrae complex
• M. fortuitum complex

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La tassonomia dei micobatteri

• fino agli anni 80
• basata esclusivamente sui caratteri fenotipici
• negli ultimi 15 anni
• sempre più basata sui caratteri genotipici

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Tassonomia basata sul genotipo

• Le varie regioni del genoma sono soggette alle
  mutazioni in maniera diversa
• I geni che codificano per funzioni essenziali
  (house keeping genes) sono poco soggetti alle
  mutazioni e le rare sostituzioni di nucleotidi
  sono conservative
• Nelle regioni non codificanti le mutazioni sono
  largamente tollerate
• A metà strada si collocano le regioni codificanti
  per funzioni non essenziali e, fra le regioni
  non codificanti, quelle che vengono trascritte

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Principali target genetici degli studi tassonomici

• 16S rDNA
• 23S rDNA
• hsp65
• ITS
• rpoB

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Il 16S rRNA

• 1.500 pb
• altamente conservato
• divergenza lt6
• singola copia nei micobatteri a crescita lenta
  doppia copia in quelli a crescita rapida
• 2 regioni ipervariabili
• A elica 10 (inizio posiz. 120)
• B elica 18 (inizio posiz. 430)

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Lelica 18 del 16S rRNA
M. tuberculosis 5 CCA TCG ACG AAG GTC
CGG GTT CTC TCG GAT TGA CGG TAG GTG GAG AAG AAG
C M. chelonae 5 GTA GGG ACG AAG CGA
AGG TGA CGG TAC CTA CAG AAG AAG G M. simiae
5 GCA GGG ACG AAG CGC AAG TGA CGG TAC
CTG CAG AAG AAG C M. terrae 5 GTA TCG GCG AAG
CTC CGT GGT TTT CTG CGG GGT GAC GGT AAC TGG AGA
AGA AGC  
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Lelica 18 del 16S rRNA
M. tuberculosis 5 CCA TCG ACG AAG GTC
CGG --G TTC TCT CGG ATT GAC GGT AGG TGG AGA AGA
AGC M. chelonae 5 GTA GGG ACG AAG
CGA AGG --- --- --- --- --T GAC GGT ACC TAC AGA
AGA AGG M. simiae 5 GCA GGG ACG
AAG CGC AAG --- --- --- --- --T GAC GGT ACC TGC
AGA AGA AGC M. terrae 5 GTA TCG GCG AAG CTC
CGT GGT TTT CTG CGG GGT GAC GGT AAC TGG AGA AGA
AGC  
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Lelica 10 del 16S rRNA
M. tuberculosis 5 CAC TTC GGG ATA AGC CTG GGA
AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA GGA CCA CGG GAT GCA
TGT CT M. simiae 5 CAC TTC GGG ATA AGC
CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TGA CCA CGG
AAC GCA TGT TT M. chelonae 5 CAC TCT GGG
ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TGA
CCA CAC ACT TCA TGG TG M. terrae 5 CAC
TCT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG
ATA GGA CCG CGC GCT TCA TGG TG M. smegmatis
5 CAC TTT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA
TAC CGA ATA GAC CCT TCT GAT CCG ATG GTC
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Lelica 10 del 16S rRNA
M. tuberculosis 5 CAC TTC GGG ATA AGC CTG GGA
AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA GG-A CCA CGG GAT GCA
TGT CT M. simiae 5 CAC TTC GGG ATA AGC
CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TG-A CCA CGG
AAC GCA TGT TT M. chelonae 5 CAC TCT GGG
ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TG-A
CCA CAC ACT TCA TGG TG M. terrae 5 CAC
TCT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG
ATA GG-A CCG CGC GCT TCA TGG TG M. smegmatis
5 CAC TTT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA
TAC CGA ATA GACC CTT CTG ATC CGA TGG TC
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Filogenesi basata sul 16S rDNA

• Micobatteri a crescita lenta
• Specie a crescita lenta classiche
• Specie correlate a M. simiae
• Specie correlate a M. terrae
• Micobatteri a crescita rapida
• Specie a crescita rapida classiche
• Specie a crescita rapida termotolleranti

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I T S

• Spaziatore interposto fra rDNA 16S e rDNA 23S
• Lunghezza compresa fra 270 a 400 pb con
  variabilità concentrata in un tratto di 220 pb
• Molte specie ne hanno più di una copia
• A causa dellelevata variabilità molte specie
  sono caratterizzate da più di un sequevar nel
  ITS i sequevar sono particolarmente numerosi in
• MAC
• M. fortuitum complex
• M. gordonae
• M. kansasii

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23S rDNA

• 3.115 pb
• Tratto variabile lungo 250 pb
• Altissimamente conservato, alcune specie (in
  particolare quelle del MAC) non sono ben
  differenziabili

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hsp65

• Gene codificante per la heath shock protein da 65
  kDa
• Lunghezza 4.400 pb con 2 regioni ipervariabili
  incluse in un tratto variabile di 420 pb
• Variabilità superiore a quella del 16S rDNA
• Miglior potere discriminatorio delle specie
  strettamente correlate
• Bassa variabilità intra-specie

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rpoB

• Gene lungo 3.500 pb codificante per una (la ß)
  delle 5 subunità della RNA polimerasi, il
  principale enzima del processo di trascrizione
• Altamente conservato ma più variabile del 16S
  rDNA
• Presente in singola copia
• Un tratto ipervariabile di 300 pb, include lhot
  spot in cui si concentrano le mutazioni associate
  alla resistenza alla rifampicina
• Un secondo tratto ipervariabile di 720 pb è
  particolarmente idoneo ala differenziazione delle
  specie micobatteriche a crescita rapida
• Ceppi con divergenza gt3 specie differenti
• Ceppi con divergenza lt2 singola specie

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Contenuto di GC

• I micobatteri hanno un contenuto di guanina
  citosina (61 - 71 mol) più alto rispetto agli
  altri microorganismi
• Alcuni generi correlati al genere Mycobacterium
  hanno un alto contenuto di GC
• Linformazione fornita dal contenuto di GC ha
  un significato grossolanamente comparabile a
  quello dellalcol-acido resistenza

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Analisi filogenetica

• Il tipo e la posizione delle mutazioni forniscono
  importanti informazioni per la filogenesi
• Gli alberi filogenetici sono rappresentazioni
  grafiche del cammino dellevoluzione
• Diversi algoritmi
• Neighbor joining, Maximum likelihood, . . .
• Bootstrap analisi della robustezza dellalbero
• Diverse rappresentazioni grafiche
• Fenogrammma, cladogramma, curvogramma, . . .

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Analisi filogenetica

• Il tipo e la posizione delle mutazioni forniscono
  importanti informazioni per la filogenesi
• Gli alberi filogenetici sono rappresentazioni
  grafiche del cammino dellevoluzione
• Diversi algoritmi
• Neighbor joining, Maximum likelihood, . . .
• Bootstrap analisi della robustezza dellalbero
• Diverse rappresentazioni grafiche
• Fenogrammma, cladogramma, curvogramma, . . .

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Analisi filogenetica

• Il tipo e la posizione delle mutazioni forniscono
  importanti informazioni per la filogenesi
• Gli alberi filogenetici sono rappresentazioni
  grafiche del cammino dellevoluzione
• Diversi algoritmi
• Neighbor joining, Maximum likelihood, . . .
• Bootstrap analisi della robustezza dellalbero
• Diverse rappresentazioni grafiche
• Fenogrammma, cladogramma, curvogramma, . . .

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Analisi filogenetica

• Il tipo e la posizione delle mutazioni forniscono
  importanti informazioni per la filogenesi
• Gli alberi filogenetici sono rappresentazioni
  grafiche del cammino dellevoluzione
• Diversi algoritmi
• Neighbor joining, Maximum likelihood, . . .
• Bootstrap analisi della robustezza dellalbero
• Diverse rappresentazioni grafiche
• Fenogrammma, cladogramma, curvogramma, . . .

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Discrepanze emergenti dallanalisi filogenetica
di regioni diverse

• Correlazioni in base al 16S rDNA
• Complesso M. fortuitum, M. peregrinum
• Complesso M. chelonae, M. abscessus
• Complesso M. smegmatis
• Correlazioni in base al rpoB
• Complesso M. fortuitum, M. peregrinum
• Complesso M. chelonae, M. abscessus
• Complesso M. mucogenicum
• Complesso M. mageritense
• Complesso M. smegmatis
• Complesso M. wolinskyi

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Una proposta interessante

• Lanalisi filogenetica di vari geni combinati in
  ununica sequenza ne aumenta il potere
  discriminatorio
• Geni sparsi qua e là nel genoma forniscono
  unimmagine più fedele dellevoluzione
  dellintero cromosoma
• PROBLEMA non esiste un database

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Evoluzione dei micobatteri
a crescita lenta
a crescita lenta, correlati a M. terrae
a crescita lenta, correlati a M. simiae
a crescita rapida, termotolleranti
a crescita rapida
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I caratteri fenotipici

• Caratteri biochimici
• Caratteri colturali
• Velocità di crescita
• Pigmento
• Temperature di crescita
• Analisi dei lipidi di parete
• Sensibilità agli antibiotici

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Principali caratteri tassonomici

• Ruolo centrale del genotipo (sequenziamento e/o
  omologia DNA-DNA)
• Criteri fenotipici di esclusione
• Velocità di crescita
• Pigmento
• Temperature di crescita
• Composizione lipidica della parete
• Caratteri fenotipici ausiliari
• Sensibilità agli antibiotici (specie a crescita
  rapida)

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Gennaio 2009 il genere Mycobacterium

• 133 specie ufficialmente riconosciute
• 7 specie, ben caratterizzate, ma non
  ufficialmente riconosciute
• Specie a crescita rapida 53
• Specie a crescita lenta 47
• Specie non cromogene 51
• Specie scotocromogene 46
• Specie fotocromogene 3
• Specie patogene 61
• Specie isolate esclusivamente dallambiente 17
• Specie isolate dalluomo ma non patogene 16
• Specie isolate esclusivamente da animali 6