Title: Tassonomia del genere Mycobacterium
1Tassonomia del genere Mycobacterium
- Enrico Tortoli
- Centro Regionale di Riferimento
- per i Micobatteri
- Firenze
2Le pietre miliari della tassonomia
- Adamo è autorizzato da Dio a dare un nome a tutti
gli esseri viventi (Genesi 2.19) - 4o secolo a.C., Aristotele si cimenta nella
differenziazione di piante ed animali - 1o secolo d.C., Plinio il vecchio dedica 4 libri
della Naturalis historia alla zoologia, e 8 alla
botanica - 18o secolo Linneo introduce il sistema binomio
3Pietre miliari nella tassonomia dei micobatteri
- 1896 Lehmann e Neuemann descrivono
- Il genere Mycobacterium
- M. leprae
- M. tuberculosis
- 1899 descrizione di
- M. smegmatis
- M. phlei
- 1901 descrizione di M. avium
- 1923 descrizione di
- M. paratuberculosis
- M. chelonae
- 1926 descrizione di M. marinum
- 1938 descrizione di M. fortuitum
4Pietre miliari nella tassonomia dei micobatteri
- 1967 L. Wayne fonda lo IWGMT
- Analisi dei caratteri fenotipici
- Tassonomia numerica
- Studi cooperativi
- 1987 lo IWGMT riconosce il valore degli studi
basati sullomologia del DNA - Ceppi con omologia gt70 appartengono alla stessa
specie - 1990 E. Böttger adotta, per primo, il
sequenziamento genico per lanalisi della
tassonomia del genere Mycobacterium
5Classificazione
- regno Bacteria
- tipo Actinobacteria
- classe Actibobacteridae
- ordine Actinomycetales
- famiglia Corynebacteriaceae
- - genere Mycobacterium
6I complessi
- M. tuberculosis complex
- M. avium complex
- M. terrae complex
- M. fortuitum complex
7La tassonomia dei micobatteri
- fino agli anni 80
- basata esclusivamente sui caratteri fenotipici
- negli ultimi 15 anni
- sempre più basata sui caratteri genotipici
8Tassonomia basata sul genotipo
- Le varie regioni del genoma sono soggette alle
mutazioni in maniera diversa - I geni che codificano per funzioni essenziali
(house keeping genes) sono poco soggetti alle
mutazioni e le rare sostituzioni di nucleotidi
sono conservative - Nelle regioni non codificanti le mutazioni sono
largamente tollerate - A metà strada si collocano le regioni codificanti
per funzioni non essenziali e, fra le regioni
non codificanti, quelle che vengono trascritte
9Principali target genetici degli studi tassonomici
- 16S rDNA
- 23S rDNA
- hsp65
- ITS
- rpoB
10Il 16S rRNA
- 1.500 pb
- altamente conservato
- divergenza lt6
- singola copia nei micobatteri a crescita lenta
doppia copia in quelli a crescita rapida - 2 regioni ipervariabili
- A elica 10 (inizio posiz. 120)
- B elica 18 (inizio posiz. 430)
11Lelica 18 del 16S rRNA
M. tuberculosis 5 CCA TCG ACG AAG GTC
CGG GTT CTC TCG GAT TGA CGG TAG GTG GAG AAG AAG
C M. chelonae 5 GTA GGG ACG AAG CGA
AGG TGA CGG TAC CTA CAG AAG AAG G M. simiae
5 GCA GGG ACG AAG CGC AAG TGA CGG TAC
CTG CAG AAG AAG C M. terrae 5 GTA TCG GCG AAG
CTC CGT GGT TTT CTG CGG GGT GAC GGT AAC TGG AGA
AGA AGC
12Lelica 18 del 16S rRNA
M. tuberculosis 5 CCA TCG ACG AAG GTC
CGG --G TTC TCT CGG ATT GAC GGT AGG TGG AGA AGA
AGC M. chelonae 5 GTA GGG ACG AAG
CGA AGG --- --- --- --- --T GAC GGT ACC TAC AGA
AGA AGG M. simiae 5 GCA GGG ACG
AAG CGC AAG --- --- --- --- --T GAC GGT ACC TGC
AGA AGA AGC M. terrae 5 GTA TCG GCG AAG CTC
CGT GGT TTT CTG CGG GGT GAC GGT AAC TGG AGA AGA
AGC
13Lelica 10 del 16S rRNA
M. tuberculosis 5 CAC TTC GGG ATA AGC CTG GGA
AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA GGA CCA CGG GAT GCA
TGT CT M. simiae 5 CAC TTC GGG ATA AGC
CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TGA CCA CGG
AAC GCA TGT TT M. chelonae 5 CAC TCT GGG
ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TGA
CCA CAC ACT TCA TGG TG M. terrae 5 CAC
TCT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG
ATA GGA CCG CGC GCT TCA TGG TG M. smegmatis
5 CAC TTT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA
TAC CGA ATA GAC CCT TCT GAT CCG ATG GTC
14Lelica 10 del 16S rRNA
M. tuberculosis 5 CAC TTC GGG ATA AGC CTG GGA
AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA GG-A CCA CGG GAT GCA
TGT CT M. simiae 5 CAC TTC GGG ATA AGC
CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TG-A CCA CGG
AAC GCA TGT TT M. chelonae 5 CAC TCT GGG
ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG ATA TG-A
CCA CAC ACT TCA TGG TG M. terrae 5 CAC
TCT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA TAC CGG
ATA GG-A CCG CGC GCT TCA TGG TG M. smegmatis
5 CAC TTT GGG ATA AGC CTG GGA AAC TGG GTC TAA
TAC CGA ATA GACC CTT CTG ATC CGA TGG TC
15Filogenesi basata sul 16S rDNA
- Micobatteri a crescita lenta
- Specie a crescita lenta classiche
- Specie correlate a M. simiae
- Specie correlate a M. terrae
- Micobatteri a crescita rapida
- Specie a crescita rapida classiche
- Specie a crescita rapida termotolleranti
16I T S
- Spaziatore interposto fra rDNA 16S e rDNA 23S
- Lunghezza compresa fra 270 a 400 pb con
variabilità concentrata in un tratto di 220 pb - Molte specie ne hanno più di una copia
- A causa dellelevata variabilità molte specie
sono caratterizzate da più di un sequevar nel
ITS i sequevar sono particolarmente numerosi in - MAC
- M. fortuitum complex
- M. gordonae
- M. kansasii
1723S rDNA
- 3.115 pb
- Tratto variabile lungo 250 pb
- Altissimamente conservato, alcune specie (in
particolare quelle del MAC) non sono ben
differenziabili
18hsp65
- Gene codificante per la heath shock protein da 65
kDa - Lunghezza 4.400 pb con 2 regioni ipervariabili
incluse in un tratto variabile di 420 pb - Variabilità superiore a quella del 16S rDNA
- Miglior potere discriminatorio delle specie
strettamente correlate - Bassa variabilità intra-specie
19rpoB
- Gene lungo 3.500 pb codificante per una (la ß)
delle 5 subunità della RNA polimerasi, il
principale enzima del processo di trascrizione - Altamente conservato ma più variabile del 16S
rDNA - Presente in singola copia
- Un tratto ipervariabile di 300 pb, include lhot
spot in cui si concentrano le mutazioni associate
alla resistenza alla rifampicina - Un secondo tratto ipervariabile di 720 pb è
particolarmente idoneo ala differenziazione delle
specie micobatteriche a crescita rapida - Ceppi con divergenza gt3 specie differenti
- Ceppi con divergenza lt2 singola specie
20Contenuto di GC
- I micobatteri hanno un contenuto di guanina
citosina (61 - 71 mol) più alto rispetto agli
altri microorganismi - Alcuni generi correlati al genere Mycobacterium
hanno un alto contenuto di GC - Linformazione fornita dal contenuto di GC ha
un significato grossolanamente comparabile a
quello dellalcol-acido resistenza
21Analisi filogenetica
- Il tipo e la posizione delle mutazioni forniscono
importanti informazioni per la filogenesi - Gli alberi filogenetici sono rappresentazioni
grafiche del cammino dellevoluzione - Diversi algoritmi
- Neighbor joining, Maximum likelihood, . . .
- Bootstrap analisi della robustezza dellalbero
- Diverse rappresentazioni grafiche
- Fenogrammma, cladogramma, curvogramma, . . .
22Analisi filogenetica
- Il tipo e la posizione delle mutazioni forniscono
importanti informazioni per la filogenesi - Gli alberi filogenetici sono rappresentazioni
grafiche del cammino dellevoluzione - Diversi algoritmi
- Neighbor joining, Maximum likelihood, . . .
- Bootstrap analisi della robustezza dellalbero
- Diverse rappresentazioni grafiche
- Fenogrammma, cladogramma, curvogramma, . . .
23Analisi filogenetica
- Il tipo e la posizione delle mutazioni forniscono
importanti informazioni per la filogenesi - Gli alberi filogenetici sono rappresentazioni
grafiche del cammino dellevoluzione - Diversi algoritmi
- Neighbor joining, Maximum likelihood, . . .
- Bootstrap analisi della robustezza dellalbero
- Diverse rappresentazioni grafiche
- Fenogrammma, cladogramma, curvogramma, . . .
24Analisi filogenetica
- Il tipo e la posizione delle mutazioni forniscono
importanti informazioni per la filogenesi - Gli alberi filogenetici sono rappresentazioni
grafiche del cammino dellevoluzione - Diversi algoritmi
- Neighbor joining, Maximum likelihood, . . .
- Bootstrap analisi della robustezza dellalbero
- Diverse rappresentazioni grafiche
- Fenogrammma, cladogramma, curvogramma, . . .
25Discrepanze emergenti dallanalisi filogenetica
di regioni diverse
- Correlazioni in base al 16S rDNA
- Complesso M. fortuitum, M. peregrinum
- Complesso M. chelonae, M. abscessus
- Complesso M. smegmatis
- Correlazioni in base al rpoB
- Complesso M. fortuitum, M. peregrinum
- Complesso M. chelonae, M. abscessus
- Complesso M. mucogenicum
- Complesso M. mageritense
- Complesso M. smegmatis
- Complesso M. wolinskyi
26Una proposta interessante
- Lanalisi filogenetica di vari geni combinati in
ununica sequenza ne aumenta il potere
discriminatorio - Geni sparsi qua e là nel genoma forniscono
unimmagine più fedele dellevoluzione
dellintero cromosoma - PROBLEMA non esiste un database
27Evoluzione dei micobatteri
a crescita lenta
a crescita lenta, correlati a M. terrae
a crescita lenta, correlati a M. simiae
a crescita rapida, termotolleranti
a crescita rapida
28I caratteri fenotipici
- Caratteri biochimici
- Caratteri colturali
- Velocità di crescita
- Pigmento
- Temperature di crescita
- Analisi dei lipidi di parete
- Sensibilità agli antibiotici
29Principali caratteri tassonomici
- Ruolo centrale del genotipo (sequenziamento e/o
omologia DNA-DNA) - Criteri fenotipici di esclusione
- Velocità di crescita
- Pigmento
- Temperature di crescita
- Composizione lipidica della parete
- Caratteri fenotipici ausiliari
- Sensibilità agli antibiotici (specie a crescita
rapida)
30Gennaio 2009 il genere Mycobacterium
- 133 specie ufficialmente riconosciute
- 7 specie, ben caratterizzate, ma non
ufficialmente riconosciute - Specie a crescita rapida 53
- Specie a crescita lenta 47
- Specie non cromogene 51
- Specie scotocromogene 46
- Specie fotocromogene 3
- Specie patogene 61
- Specie isolate esclusivamente dallambiente 17
- Specie isolate dalluomo ma non patogene 16
- Specie isolate esclusivamente da animali 6