Partner 8 Dipartimento di Scienze Ambientali Universit

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Partner 8Dipartimento di Scienze
AmbientaliUniversità degli Studi di Parma

• LaRIA Laboratorio Regionale per lInnovazione
  nel controllo della qualità dellAria

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Generalità della Sezione

• La Sezione di Genetica e Biotecnologie Ambientali
  è coordinata dal Prof. Nelson MARMIROLI,
  attualmente Vice-Direttore del Dipartimento di
  Scienze Ambientali
• Comprende un Professore Ordinario, due Professori
  Associati, quattro Ricercatori, un Tecnico
• Al momento ospita unassegnista, quattro
  dottorandi, due borsisti, tre contrattisti e
  alcuni tirocinanti e tesisti di lauree triennali
  e specialistiche

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Principali attività di ricerca

• Tracciabilità attraverso le filiere
  agroalimentari per la qualità e la sicurezza
• Biotecnologie ambientali
• Interazioni tra gli organismi viventi ed il loro
  ambiente
• Controllo e ripristino della qualità ambientale

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Composizione del gruppo

• Elena Maestri (Prof. Associato)
• Alessio Malcevschi (Ricercatore)
• Giovanna Visioli (Ricercatore)
• Marta Marmiroli (Ricercatore)
• Andrea Pirondini (Dottorando)
• Un borsista da assumere

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Contributi previsti

• Sottoprogetto 1
• OR1, 43 giorni uomo
• OR2, 51 giorni uomo
• OR4, 92 giorni uomo
• OR7, 120 giorni uomo

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Approccio generale

• Lunità di ricerca propone approcci di
  bioindicazione e biomonitoraggio attivi, in cui
  piante superiori appositamente scelte in base
  alle loro caratteristiche verranno esposte in
  modo controllato a particolari condizioni di
  inquinamento atmosferico, e analizzate al termine
  del periodo di esposizione per ricavarne
  informazioni utili sul tipo e sul grado
  dellinquinamento.
• Inoltre, lUnità svilupperà strategie per il
  monitoraggio qualitativo di metalli pesanti
  mediante la rilevazione in tessuti umani
  prelevati da lavoratori professionalmente esposti
  e valuterà la frequenza, entro le categorie
  esposte, di individui ipersensibili a patologie
  dellapparato respiratorio mediante lanalisi di
  marcatori ecogenetici.

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OR1, Sviluppo di sensori a stato solido basati su
ossidi semiconduttori nanostrutturati per la
rilevazione CO, NOx,O3, SO2, NH3 e VOC e di
strategie innovative di monitoraggio tramite
biosensori

• Conoscenze pregresse
• I contaminanti aerei raggiungono la superficie
  delle piante per deposizione umida o occulta,
  deposizione gassosa a secco o deposizione di
  particolato a secco. Limportanza relativa dei
  diversi eventi dipende dal tipo di emissione,
  dalle proprietà fisico-chimiche dei contaminanti,
  dalle condizioni atmosferiche e climatiche, dalla
  struttura e dalla suscettibilità delle piante.
  Per i contaminanti volatili predomina la
  deposizione gassosa.
• Lingresso di VOC e SVOC nei tessuti vegetali
  richiede deposizione e cattura alla superficie
  esposta delle piante. Il pathway di assunzione
  dipende dalle caratteristiche chimiche della
  sostanza e da caratteristiche della pianta, ma
  leffettivo ingresso nei tessuti è modulato da
  fattori ambientali.
• La concentrazione delle sostanze volatili nella
  pianta raggiunge velocemente un equilibrio con la
  loro concentrazione nellatmosfera, e questo
  rende le piante ottime indicatici del carico
  inquinante a breve termine nel corso del
  campionamento. Per le sostanze semivolatili si
  può considerare invece un fenomeno di accumulo e
  quindi di integrazione temporale delle
  concentrazioni nel corso di esposizioni
  prolungate.

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Attività proposte

• Si svolgeranno ricerche bibliografiche per
  definire le caratteristiche dei sensori biologici
  ideali per il lavoro proposto nei successivi OR
  una volta identificate le piante che da
  esperienze precedenti o da dati riportati si
  riterranno più opportune, si procederà con
  limitati esperimenti di laboratorio per
  implementare le tecniche di coltivazione ed
  esposizione da utilizzare successivamente.
• Indicazioni già acquisite suggeriscono lutilizzo
  di
• Piante accumulatrici di xenobiotici organici
  Brassica oleracea cv. acephala Lolium
  multiflorum, Taraxacum officinale.
• Piante modello per studi di genotossicità
  Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia.
• Piante per indagini proteomiche Arabidopsis
  thaliana ecotipo Columbia

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Biomonitoraggio

• Il gruppo ha già svolto in passato esperienze di
  biomonitoraggio con piante superiori. In
  particolare, una lunga collaborazione con
  lazienda AMNU e la sezione ARPA di Parma ha
  riguardato il monitoraggio della zona circostante
  linceneritore di rifiuti, ora dismesso, e zone a
  diverso livello di traffico nella rete urbana
  della città di Parma.
• Il Comune di Santo Stefano Magra (SP) ha deciso
  di monitorare linquinamento nel trafficatissimo
  incrocio tra il raccordo autostradale e la
  statale della Cisa non per mezzo delle
  tradizionali centraline, bensì affidandosi alle
  piante. Liniziativa, denominata Pianta Mia, si
  avvale della collaborazione dellUniversità di
  Parma e ha previsto la messa a dimora, in una
  grande aiuola, alle porte del paese, di piante di
  cavolo ornamentale, bosso, aucuba, erica,
  iperico, cineraria, ginepro, evonimo e
  Cotoneaster. Nella scelta delle essenze ci siamo
  basati su precedenti studi.

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OR2, Sviluppo di sistemi per la rilevazione di
gas inquinanti in ambienti outdoor

• Conoscenze pregresse
• Le piante devono essere esposte allinquinamento
  atmosferico con le loro parti aeree, in siti dove
  laria possa circolare liberamente senza
  ostacoli, idealmente nella stessa posizione delle
  centraline di rilevamento di parametri
  fisico-chimici. La posizione deve essere elevata
  per impedire laccesso volontario o accidentale
  di persone o animali terrestri, e sarà necessaria
  una protezione contro gli uccelli. Per evitare
  effetti di dilavamento da parte delle
  precipitazioni il biosensore sarà coperto da una
  tettoia e il terreno dei vasi sarà adeguatamente
  rifornito di acqua mediante annaffiatura dal
  basso. Le piante per la captazione delle sostanze
  gassose saranno esposte allaria in sistemi
  chiusi protetti da filtri atti a fermare il
  particolato atmosferico (cellulosa).
• Per motivi di uniformità, le piante da usare come
  biosensori dovranno essere, entro specie,
  geneticamente uniformi (anche se non omozigoti),
  allevate a partire da seme o talea in condizioni
  simili e tutte con la stessa età, evitando
  esemplari evidentemente anomali o malati.

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Attività proposte

• Le attività saranno rivolte alla scelta e
  coltivazione delle piante da utilizzare come
  biosensori in numero sufficiente alla
  preparazione dei necessari sistemi di
  monitoraggio Brassica oleracea cv acephala
  coltivata da seme, Lolium multiflorum, Taraxacum
  officinale, Arabidopsis thaliana, o altre
  identificate nellOR1
• Scelta dei siti da sottoporre a monitoraggio e
  delle sostanze da analizzare in accordo con altre
  Unità
• Progettazione dei biosensori e loro preparazione
• Definizione delle metodologie per
• Analisi chimica e identificazione delle sostanze
  organiche presenti in campioni vegetali (IPA in
  foglie di Brassica oleracea cv acephala dopo 8
  settimane di esposizione)
• Analisi di polimorfismi RAPD e AFLP in piante
  modello (in situ ed ex situ) Arabidopsis
• Analisi proteomiche in Arabidopsis
• Analisi statistica dei risultati

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(No Transcript)
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esposizione
Estrazione DNA
Amplificazione PCR (RAPD)
elettroforesi
analisi
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Analisi di polimorfismi

• La valutazione della frequenza di mutazioni
  insorte nel corso dellesposizione ai
  contaminanti si effettuerà calcolando il numero
  di polimorfismi evidenziabili allinterno della
  popolazione esposta in confronto al numero di
  polimorfismi evidenziabili in popolazioni di
  controllo mantenute in ambienti controllati
  (camera di crescita) senza alcuna esposizione.
  Lipotesi di lavoro è che nelle popolazioni non
  esposte insorgano poche o nessuna mutazione, e
  che nelle popolazioni esposte ne insorgano con
  maggiore frequenza, portando quindi a un numero
  di polimorfismi maggiore nelle popolazioni
  esposte.
• Lidentificazione di polimorfismi si effettuerà
  con le tecniche basate sui marcatori molecolari
  di tipo RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e
  AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism),
  tecniche che analizzano simultaneamente decine di
  siti genomici grazie allamplificazione mediante
  PCR di frammenti a partire da inneschi molecolari
  di sequenza definita e arbitraria (Conte et al.
  1998, Chemosphere 372739-2749).
• Variazioni nel numero e nella lunghezza dei
  frammenti amplificati in individui diversi
  identificano i polimorfismi e sono indice di
  mutazioni avvenute nella popolazione esposta. Il
  numero di polimorfismi è correlabile alla durata
  dellesposizione per cercare una stima
  quantitativa della relazione tra esposizione ed
  effetto.

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Diverse combinazioni di marcatori molecolari
saggiate su piantine di Arabidopsis ottenute da
semi esposti a mutagenesi con elevate
concentrazion di metalli pesanti Cd, Pb, Mn. Il
grafico mostra i numeri relativi di prodotti di
amplificazione che erano esclusivamente presenti
negli individui trattati con Cd in
confronto con i prodotti esclusivamente presenti
nei controlli non trattati o comuni a
entrambi
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Analisi proteomiche

• Estratto proteico
• Separazione delle proteine (gel bidimensionali,
  cromatografia liquida) e individuazione di
  eventuali differenze tra diversi estratti
• Isolamento di questi spot e analisi ulteriore
  attraverso spettrometria di massa
• Individuazione della proteina attraverso appositi
  database informatici

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CROMATOGRAFIA LIQUIDA 2-D ProteomeLab PF-2D

• Consiste in una doppia colonna cromatografica
• La prima colonna separa il campione secondo il
  punto isolettrico High-performance
  chromatofocusing (HPCF).
• Le frazioni cosi ottenute vengono raccolte e
  iniettate allinterno della seconda colonna
  cromatografica che ci permette di separare le
  proteine secondo la loro polarita
  high-resolution reversed-phase chromatography
  (HPRP) .

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DeltaVue è un software che serve per confrontare
le frazioni ottenute ed evidenziare eventuali
differenze qualitative e quantitative
2-D differential map of selected pH fractions
(pH range 6,17-6,47)
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OR4, Prove in campo con i prototipi dei sistemi
sviluppati nei precedenti OR

• Le attività saranno rivolte a
• Installazione e mantenimento dei biosensori
• Campionamento periodico
• Analisi chimica e identificazione delle sostanze
  organiche presenti in campioni vegetali IPA in
  foglie di Brassica oleracea cv acephala dopo 8
  settimane di esposizione
• Analisi di polimorfismi RAPD e AFLP in piante
  modello (in situ ed ex situ) Arabidopsis
• Ricerca di biomarcatori proteomici in Arabidopsis
• Analisi statistica dei risultati
• Correlazioni con dati da misure puntiformi
  forniti da altre Unità

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OR7, Biomonitoraggio di particolato atmosferico
(APM) in piante superiori e gruppi di lavoratori
professionalmente esposti

• Conoscenze pregresse - piante
• Per i contaminanti non volatili e i metalli
  pesanti predomina la deposizione come particolato
  sia umida che a secco. Solo pochi elementi
  chimici possono essere assunti a livello delle
  foglie, quali carbonio, ossigeno, azoto, fluoro,
  zolfo. Altri elementi possono però essere
  adsorbiti dalla superficie fogliare ed essere
  evidenziabili analizzando le superfici non
  lavate. Il pathway di assunzione dipende dalle
  caratteristiche chimiche della sostanza e da
  caratteristiche della pianta, ma leffettivo
  ingresso nei tessuti è modulato da fattori
  ambientali. I contaminanti legati alle
  particelle, come metalli pesanti e composti
  organici non volatili, si depositano sulla
  superficie e possono essere adsorbiti alla
  cuticola, inglobati in essa oppure addirittura
  assunti tramite essa. Lo strato ceroso agisce
  come accumulatore di inquinanti particolati.
• Si è dimostrato che nella cuticola si accumulano
  elementi che comprendono Cr, Cu, Fe, Hg, Ni, Pb,
  e che questi non possono essere dilavati
  facilmente delle precipitazioni. Elementi quali
  Mg, K, Ca, Cd e Zn non si legano invece
  significativamente alla cuticola. Tutti questi
  elementi possono comunque essere distribuiti ad
  altre parti della pianta.
• Lapporto di composti organici da parte del
  particolato è significativo solo per molecole con
  coefficienti di ripartizione ottanolo/aria
  superiori a 11, quali diossine e furani, e
  composti policiclici aromatici con più di 5
  anelli.

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Attività previste (sovrapposizioni con OR4)

• Scelta dei siti
• Scelta e coltivazione delle piante
• Installazione e mantenimento dei biosensori
• Campionamento periodico
• Analisi chimica e identificazione delle sostanze
  organiche presenti in campioni vegetali
• Analisi SEM/EDX del particolato presente sui
  campioni di foglie Lolium e Taraxacum e altre
  specie
• Analisi di polimorfismi RAPD e AFLP in piante
  modello (in situ ed ex situ) Arabidopsis
• Ricerca di biomarcatori proteomici in Arabidopsis
• Analisi statistica dei risultati
• Correlazioni con dati da misure puntiformi
  forniti da altre Unità

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Analisi chimiche

• Le analisi chimiche (ICP-OES) e spettroscopiche
  (SEM/EDX) sono state applicate negli ultimi 7
  anni a diverse piante in diversi contesti
• Piante di interesse agricolo per valutare il
  flusso di metalli pesanti nelle parti
  commestibili
• Piante iperaccumulatrici di nichel da siti
  naturalmente contaminati per rilevare i siti di
  accumulo e le differenze con congeneri non
  accumulatori
• Piante arboree sottoposte a trattamento con
  piombo per identificare i siti di accumulo nella
  radice
• Piante modello geneticamente modificate per
  evidenziare il trasporto di cesio
• Piante acquatiche in celle di trattamento per
  reflui caseari per evidenziare laccumulo di
  contaminanti inorganici e nutrienti

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Alyssum
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Phragmites
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Juglans
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OR7, Biomonitoraggio di particolato atmosferico
(APM) in piante superiori e gruppi di lavoratori
professionalmente esposti

• Conoscenze pregresse ipersensibilità
• Il particolato atmosferico è ritenuto
  responsabile della maggior parte degli effetti
  avversi sulla salute umana provocati
  dallinquinamento atmosferico. Unesposizione ad
  alti livelli e prolungata nel tempo aumenta i
  rischi di cancro, malattie respiratorie,
  arteriosclerosi, mentre le brevi esposizioni
  esacerbano bronchiti e asma. Gli effetti si
  correlano alla presenza di IPA, metalli di
  transizione, benzene. Una valutazione
  dellesposizione a livello dei singoli individui
  della popolazione sarebbe un primo passo per
  stabilire relazioni tra causa ed effetto nelle
  patologie provocate dallinquinamento. La
  valutazione dellesposizione individuale può
  essere eseguita misurando un biomarcatore
  meccanicisticamente correlato, che sia sensibile
  e specifico. Ad esempio, il metabolita
  1-idrossipirene (1-HP) nelle urine è considerato
  un biomarcatore di esposizione a IPA.
• Per quanto riguarda lesposizione a metalli
  pesanti, lanalisi degli elementi nei capelli è
  considerata una buona fonte di informazione. I
  capelli riflettono la presenza di metalli e altri
  elementi nel sangue e sono considerati utili
  specialmente per individui professionalmente
  esposti. Anche altri peli corporei possono essere
  usati per lo stesso scopo.
• Un importante gruppo di contaminanti del
  particolato sono gli IPA, ad effetto cancerogeno,
  e la loro attività mutagena dipende spesso dalla
  attivazione metabolica ad opera di enzimi, in
  particolare citocromi P450 monossigenasi della
  famiglia CYP1A1. Perciò si considera che
  variazioni nei livelli individuali di attività
  enzimatica CYP1A1 possano essere correlate con
  variazioni nella sensibilità individuale ai danni
  prodotti da questi composti. Valutare i
  polimorfismi genetici per questo gene (di cui
  sono noti 9 alleli), e quindi la frequenza di
  questo marcatore ecogenetico, consente di stimare
  lesistenza di individui ipersensibili nella
  popolazione. La presenza di individui
  ipersensibili nelle categorie di lavoratori
  professionalmente esposti allinquinamento
  atmosferico è quindi un ulteriore fattore di
  rischio occupazionale, che dovrebbe essere
  conosciuto per meglio prevenire linsorgenza di
  malattie gravi.

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Attività proposte

• Gruppi di lavoratori professionalmente esposti
  autisti di mezzi pubblici, addetti alla
  distribuzione della posta, vigili urbani.
  Controllo colleghi che lavorano in ufficio (non
  esposti) con simile distribuzione per sesso, età,
  abitudini relative al fumo.
• Scelta dei gruppi da sottoporre a monitoraggio
  per marcatori ecogenetici di suscettibilità, per
  metabolici di IPA nelle urine e per il contenuto
  di metalli pesanti nei capelli. Ottenimento delle
  autorizzazioni e dei consensi.
• Analisi delle abitudini di vita e lavorative,
  costituzione dei gruppi esposti e di controllo,
  identificazione dei periodi di esposizione.
• Campionamento periodico
• Analisi chimica di idrossipirene nelle urine
• Analisi SEM/EDX di campioni di capelli
• Analisi di polimorfismi in marcatori ecogenetici
  CYP1A1 (metabolismo degli IPA), CYP2E1
  (metabolismo del benzene), NQO1 (detossificazione
  di chinoni), GSTM1 e GSTT1 (inattivazione per
  coniugazione).
• Analisi statistica dei risultati
• Correlazioni con dati da misure puntiformi
  forniti da altre Unità

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Analisi di marcatori ecogenetici

• A causa della diversità genetica tra individui,
  gli appartenenti a popolazioni umane diverse sono
  diversamente suscettibili agli agenti inquinanti,
  e più o meno predisposti allo sviluppo di
  sintomatologie patologiche
• Lidentificazione di questi fattori genetici
  polimorfici, attuabile attraverso tecniche
  biotecnologiche, è molto importante per
  comprendere il fenomeno che chiamiamo
  ipersuscettibilità individuale
• Esempio
• Lenzima alfa1-antitripsina del siero è un
  fattore di suscettibilità
• Infatti, la carenza di questo enzima sarebbe
  connessa allo sviluppo di patologie
  broncopolmonari (enfisema) e del fegato
• Il rischio è ulteriormente aumentato da
  particolari abitudini di vita, come il fumo
• Quindi, un individuo carente per questo enzima,
  se esposto allinquinamento atmosferico, ha una
  maggiore probabilità di ammalarsi rispetto ad
  altri individui. Se inoltre fosse un fumatore, il
  rischio sarebbe ancora maggiore.

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Esperienza del gruppo

• Il gruppo ha una lunga esperienza nellanalisi di
  marcatori genetico-molecolari in organismi
  diversi. Di recente, il laboratorio si è dotato
  di sofisticate strumentazioni per lanalisi
  genetica che faciliteranno questa parte del
  lavoro (sequenziatore automatico di acidi
  nucleici, RealTime PCR).
• Per quanto riguarda lanalisi di elementi chimici
  quali i metalli pesanti in tessuti, da diversi
  anni il gruppo proponente ha applicato tecniche
  di microanalisi a scansione e microfluorescenza
  alla descrizione qualitativa e quantitativa della
  localizzazione tissutale di Pb, Ni, Cu, Zn, Cs ed
  altri elementi in diverse specie vegetali. Tale
  esperienza è facilmente estendibile a tessuti di
  provenienza umana.
• Contatti con colleghi dellarea medica sono già
  stati intrapresi.