Gen

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Genômica e Proteômica

• Montagem de genomas

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Introdução

• Queremos conhecer a seqüência de parte ou de todo
  o DNA de um organismo
• A tecnologia disponível só recupera pequenas
  seqüências de DNA. No máximo 700-800 pb. Em média
  450 pb
• Se queremos pedaços maiores de DNA, temos que a
  partir destas pequenas seqüências, montar um
  quebra-cabeças

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Introdução

• Um tipo diferente de quebra-cabeças. Temos as
  peças, mas não sabemos o resultado final
• Freqüentemente, nem temos todas as peças
• É um problema computacional complexo!
• Como ?

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Introdução

• Definir a estratégia de seqüenciamento
• Gerar as seqüências
• Construção e validação de bibliotecas
• Seqüênciar
• Montar
• Finalizar a seqüência genômica

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Estratégia de seqüenciamento

• Clone-by-clone (Primeiro mapear, depois
  seqüênciar)
• Whole-genome shotgun sequencing
• Hybrid shotgun sequencing
• Expressed Sequence Tag - EST

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Clone-by-clone e Whole-genome shotgun sequencing
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Whole-genome shotgun sequencing
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Whole-genome shotgun sequencing
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Hybrid shotgun sequencing
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Expressed Sequence Tag
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Bibliotecas

• Em qualquer estratégia temos que construir
  bibliotecas de seqüências de DNA
• As bibliotecas devem ser validadas. Garantir
• Que as seqüências tenham o tamanho esperado
• Que não exista contaminação e presença excessiva
  de vetores
• Que a distribuição das seqüências seja a esperada
• Para EST as bibliotecas podem ser de diferentes
  tecidos

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Bibliotecas
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Administração e gerência

• No caso de redes de seqüenciamento, recepcionar
  os cromatogramas
• Armazenar os cromatogramas
• Gerar relatórios sobre o seqüenciamento
• Divulgação de estatísticas sobre o
  desenvolvimento do projeto

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Administração e gerência
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Administração e gerência
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Administração e gerência
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Estratégia híbrida

• Leitura dos cromatogramas ? converter os dados
  provenientes de seqüenciadores (reads) em
  seqüências de nucleotídeos, associando a cada um
  o seu respectivo valor de qualidade
• Montagem ? comparar as seqüências, utilizando
  também os valores de qualidade, para encontrar a
  sobreposição entre elas e gerar as seqüências de
  consenso, chamadas contigs
• Objetivo Um contig !!!

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Estratégia híbrida

• Analisar a montagem
• Acompanhar a evolução do número de contigs ?
  Determinar quando se deve parar o seqüenciamento
  de bibliotecas e/ou iniciar o processo de
  finalização do genoma
• Identificar problemas de montagem. Ex. Presença
  de repetições gerando montagens erradas

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Estratégia híbrida

• Finalizar o genoma
• Ordenar e orientar os contigs (scaffold)
• Utilizar os clones de shotgun e de outras
  bibliotecas (cosmídoes, bacs etc) para construir
  os scaffolds
• Definir estratégias específicas para fechar
  gaps espaços entre contigs no genoma
• Garantir que todas as bases tenham um valor
  mínimo de qualidade, para que tenhamos no máximo
  uma base errada em um milhão.

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Leitura dos cromatogramas

• A leitura dos cromatogramas é a realizada pelo
  programa phred
• O phred nomeia cada base e atribue um valor de
  qualidade para cada base lida
• A qualidade está relacionada a probabilidade que
  tenha ocorrido um erro na nomeação da base

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Leitura dos cromatogramas

• Q -10 log10( Pe )
• Q ? Qualidade e Pe ? Probabilidade de erro
• Ex. 1 erro em 100 bases
• Q -10 log10(1/100) ? Q 20
• Ex. 1 erro em 10000 bases
• Q -10 log10(1/10000) ? Q 40
• Ex. 1 erro em 1000000 bases
• Q -10 log10(1/1000000) ? Q 60

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Leitura dos cromatogramas
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Leitura dos cromatogramas
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Leitura dos cromatogramas

• O phred gera um arquivo contendo as bases e as
  respectivas qualidades

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Filtragem de vetores

• Trechos de seqüências de DNA correspondentes a
  vetores devem ser filtradas
• Utiliza-se um programa (cross_match) de
  alinhamento de seqüências para procurar na
  seqüência de cada fragmento a presença do vetor
• O trecho correspondente tem cada uma de suas base
  substituídas por x

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Filtragem de vetores
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Montagem

• Determinar a ordem e orientação de uma coleção de
  fragmentos de um mesmo DNA

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Montagem
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Programas / pacotes de montagem

• Assembler (www.tigr.org)
• Bambus Programa para gerar scaffold
• CAP3 (genome.cs.mtu.edu)
• phred/phrap/consed (www.phrap.org)
• Staden (www.mrc-lmb.cam.ac.uk) GAP4
• Pode utilizar o CAP3 ou o phrap

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CAP3

• Identificação e remoção de regiões de baixa
  qualidade, no início e no fim dos reads
• Alinhamento entre reads para identificação de
  sobreposição
• Identificação e remoção de falsos alinhamentos

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CAP3

• Formação dos contigs através da junção dos reads
  em ordem decrescente da pontuação dos
  alinhamentos
• Correção nos contigs através da validação
  forward-reverse
• Alinhamento múltiplo dos reads para a construção
  da seqüência de consenso
• Geração dos arquivos de saída (links, ace etc)

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phrap

• Tratamento das seqüências
• Conversão de trechos de bases iguais, no início e
  no fim dos reads em N
• Identificação e exclusão de reads iguais
• Exclusão de regiões, provavelmente não filtradas,
  de vetores do alinhamento
• Determinação dos singlets (reads que não tem
  alinhamento com nenhum outro read)

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phrap

• Identificação de sobreposição
• Formação dos contigs
• Determinação do consenso
• Determinação dos links entre contigs e do
  scaffold
• Geração dos arquivos de saída (log, ace, contigs
  etc)

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Pipeline da montagem
Conversão (phd2fasta) phd_files ? multifasta e
multifasta.qual
Montagem (phrap / cap3)
Filtragem (cross_match) de vetores e repetições
? multifasta.screen
Arquivo de Clones (formcon) ?
multifasta.screen.con
Somente para o CAP3
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Análise da montagem
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Análise da montagem
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Análise da montagem
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Análise da montagem
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Identificação de repetições

• Repetição trechos de DNA ao longo do(s)
  cromossomo(s)
• Se a repetição tiver um tamanho próximo ou maior
  que a média do tamanha dos reads, o programa de
  montagem pode colocá-lo em uma região errada

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Identificação de repetições

• Repetições ambíguas

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Identificação de repetições

• Repetições colapsadas

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Identificação de repetições

• Como identificar
• Regiões de contigs que empilham reads
• Regiõe(s) que têm match com outras regiõe(s)
• Regiões que apresentam links de pontas de clones
  inconsistentes
• Regiões em que existem mais de um read com bases
  discrepantes em relação ao consenso

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Identificação de repeats

• Regiões que empilham reads

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Identificação de repeats

• Regiõe(s) que têm match com outras regiõe(s)

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Identificação de repeats

• Regiõe(s) que têm match com outras regiõe(s)

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Identificação de repeats

• Regiões que apresentam links de pontas de clones
  inconsistentes

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Identificação de repeats

• Regiões em que existem mais de um read com bases
  discrepantes em relação ao consenso

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Problemas nos contigs

• Low Consensus Quality (LCQ) ? É uma região do
  consenso, cujas bases possuem qualidade menor ou
  igual a 25. Indica uma região que está coberta
  por reads de baixa qualidade.
• High Quality Discrepancies (HQD) ? São bases de
  um read que estão discrepantes em relação ao
  consenso e são de qualidade superior a 40.
• Positions not Confirmed on both Strands (NCBS) ?
  Posições no consenso que não estão confirmadas
  nas duas fitas.
• Reads quiméricos

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Problemas nos contigs - LCQ
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Problemas nos contigs - HQD
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Problemas nos contigs - HQD
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Problemas nos contigs - NCBS
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Problemas nos contigs - Quimera
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Finalização do genoma

• Estratégias para resolver os problemas de
  montagem dos contigs (LCQ, HQD, NCBS, quimeras)
• Estratégias para resolver os problemas de
  repetição ? Fechar os gaps gerados pelos filtros
• Estratégias para fechar os demais gaps. Gaps
  dentro de scaffolds (virtuais) e entre scaffolds
  (reais)

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Finalização do genoma -- HQD

• Retirar os reads que contenham HQD, remontar o
  contig isoladamente e comparar as seqüências
• Retirar o(s) read(s)s que determina(m) o
  consenso, remontar o contig isoladamente e
  comparar as seqüências (muitos reads e muitas
  bases com HQD)
• Ressequenciar reads da região

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Finalização do genoma LCQ e NCBS

• Ressequenciar reads que estejam com baixa
  qualidade
• Desenhar e sequenciar reads de primer
• Gerar uma subblioteca de um clone e sequenciá-lo
  completamente.

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Finalização do genoma Quimeras

• Retirar os reads quiméricos . Realizar a montagem
  isolada e comparar os consensos
• Se houver diferença, ressequenciar reads da
  região, inclusive o quimérico

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Finalização do genoma fechamento de gaps

• Ressequenciar reads que estejam com baixa
  qualidade nas extremidades dos contigs
• Desenhar e sequenciar reads de primer
• Gerar uma subblioteca de um clone e sequenciá-lo
  completamente.

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Finalização do genoma fechamento de gaps
(filtro)

• Montar separadamente os dois contigs de cada gap,
  ou apenas, as duas extremidades.
• Pode ser necessário montar com diferentes
  programas (cap3 e phrap) para estabelecermos
  comparações
• Garantir que, na medida do possível, os clones
  estejam com as duas pontas (forward e reverse).
  Resgatar, para isto, as pontas que se tornaram
  singlets

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Finalização do genoma fechamento de gaps
(filtro)

• Realizar experimentos que confirmem que os dois
  contigs do gap realmente estão juntos e na
  orientação indicada pelo scaffold (Ex. PCR
  combinatório)
• Desenhar e sequenciar reads de primer
• Gerar uma subblioteca de um clone e sequenciá-lo
  completamente.
• Sequenciar o produto de PCR

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Genomas montados no LABINFO

• Chromobacterium violaceum e Mycoplasma synoviae
  (www.brgene.lncc.br)
• Mycoplasma hyopneumoniae J e Mycoplasma
  hyopneumoniae 7448 (www.genesul.lncc.br)

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Genomas em andamento no LABINFO

• Xylella fastidiosa Ann1 e Xylella fastidiosa
  Dixon (www.xylella.lncc.br)
• Rhizobium tropici (www.nbf.lncc.br)
• Leifsonia xyli cynodontis (www.leifsonia.lncc.br)

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EST

• A montagem de EST, é na verdade, a construção de
  clusters (grupos) de seqüências de EST que são
  originadas da expressão de um mesmo gene
• O pipeline é semelhante a montagem de genomas
  completos. Com exceção da filtragem de repeats.
• Tanto o programa CAP3, quanto o phrap podem ser
  utilizados

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Referências

• Green, ED Strategies for the systematic
  sequencing of comples genomes (Nature Reviews
  Genetics, vol 2, agosto 2001, 573-583)
  (http//www.nature.com/cgi-taf/DynaPage.taf?file/
  nrg/journal/v2/n8/full/nrg0801_573a_fs.html)
• Huang, X e Madan, A CAP3 A DNA Sequence
  Assembly Program (Genome Research)
• www.phrap.org
• Telles, GP et all - Bioinformatics of the
  sugarcane EST project (Genetics and Molecular
  Biology, vol 24, n1-4, 2001)
• Telles, GP e Silva FR Trimming and clustering
  sugarcane ESTs (Genetics and Molecular Biology,
  vol 24, n1-4, 2001)