Diapositiva 1

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Onda electromagnética cambios periódicos de un
campo magnético (M) y un campo eléctrico (E) en
el espacio y en el tiempo, que se propagan a la
velocidad de la luz. En cualquier punto, M es
perpendicular a E, ambos oscilan en planos
perpendiculares a la dirección de propagación.
Onda EM polarizada en un plano (vertical) se
representa sólo el vector E (en verde)
Onda EM polarizada en un plano (horizontal) se
representa sólo el vector E (en rojo)
Tomado de http//com,mons.wikimedia.org/wiki/Image
Circular_Dichroism
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2 ondas polarizadas en un plano, en fase
(alcanzan picos y cero al mismo tiempo)
Vector resultante luz polarizada en un plano
pero a 45º respecto a los componentes iniciales
Tomado de http//com,mons.wikimedia.org/wiki/Image
Circular_Dichroism
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2 ondas polarizadas en un plano pero desfasadas
90º (o -90º) o sea una alcanza maximos (o
mínimos) cuando la otra pasa por cero
Vector resultante rota en un círculo luz
polarizada circularmente
a derecha
a izquierda
Propagación de la onda resultante en
espiral (no sinusoidal)
Tomado de http//com,mons.wikimedia.org/wiki/Image
Circular_Dichroism
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Interacción de luz polarizada con la materia
Luz polarizada en un plano, al interaccionar con
medio que absorbe (no birrefringente)
Luz trasmitida polarizada en igual plano, pero de
menor intensidad (menor amplitud, igual
frecuencia)
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Luz polarizada circularmente al interaccionar con
medio que absorbe (no birrefringente)
Luz trasmitida polarizada también circularmente,
pero de menor intensidad (menor amplitud, igual
frecuencia)
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2 ondas polarizadas circularmente a derecha e
izquierda, de la misma amplitud
Vector resultante luz polarizada en un plano
Tomado de http//com,mons.wikimedia.org/wiki/Image
Circular_Dichroism
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Luz polarizada circularmente al interaccionar con
medio que absorbe diferencialmente a izquierda y
derecha
Absorbe luz polarizada circularmente a derecha
(verde)
No absorbe luz polarizada circularmente a
izquierda (rojo)
Luz trasmitida polarizada elípticamente CD
transforma luz incidente polarizada en un plano
en luz polarizada elípticamente
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DICROISMO CIRCULAR Mide la capacidad de moléculas
ópticamente activas de absorber diferencialmente
la luz polarizada circularmente a izquierda y a
derecha
A absorbancia a determinada l
e coef. Absortividad molar (M-1 cm-1) C conc.
(en M) de la muestra l paso optico
                    
? elipticidad (medida en grados, deg) ?
elipticidad molar (deg cm2 dmol-1)
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Como la elipticidad es un valor pequeño en
general, tan ? ? (radianes) Como la intensidad
de la radicación I es proporcional a E2
Como ?Altlt1, se puede aproximar usando serie de
Taylor y convirtiendo radianes a grados
? (deg) 33 DA
? ? x 100 x MW c ( mg/mL) x l (cm)
? (deg cm2 dmol-1) 3300 De
10
? (deg) 33 DA
?(deg) x 100/ l C 3300 De ? molar (deg cm2
dmol-1)

• Para una medida ? 10 mdeg, DA 0.0003 !!!
• buena estabilidad del espectropolarímetro
• cuvetas de cuarzo fundido alta transparencia
• temperatura controlada
• en UV lejano molestan algunas sales de buffers,
  O2 (degasear)

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Espectros CD de proteínas
Región UV lejano, región amida 170 - 250
nm Dominada por contribución del enlace
peptídico. Da información sobre estructura
secundaria. Absorción característica a-hélice
(2 mínimos a 208 y 222 nm y máximo a 190 nm) ß
plegada (1 mínimo a 217 nm y 1 máximo a 195 nm)
Información muy confiable para proteínas con
fuerte a-hélice, comparable a Dif RX o
RMN Región UV cercano 250 300
nm Contribución de aminoácidos aromáticos y
disulfuros Da información sobre estructura
terciaria Criterio muy sensible del estado nativo
de la proteína
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CD lejano Proteína recombinante vs proteína
natural
CD cercano proteína (anticuerpo monoclonal) de
2 distintos lotes de producción
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Variación de la elipticidad (? a 220 nm) con la
temperatura. La misma concentración de proteína
pero en buffers a distintos pH línea azul
pH 6.0, línea verde 7.4, línea celeste pH 8.5
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Dicroismo circular UV lejano de proteínasCálculo
de cantidad relativa de estructura secundaria
?i (?) Espectro CD base para cada estructura
secundaria i (polipéptidos sintéticos o
proteínas modelo) ?(?) fa ?a (?) f ß
?ß (?) f t ?t (?) fR ?R (?) a
a-hélice ß ß plegada t giros (turn) R
ovillo estadístico (Random coil) Sf i 1 f i
se obtiene resolviendo para un set de ?
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• Aplicaciones CD-UV de proteínas
• Estimar de estructura secundaria
  (fracción de la proteína como a-hélice,
  b plegada, giro b u otra)
• Cambios en estructura secundaria
  (con temperatura, agentes
  desnaturalizantes)
• Verificar si la proteína está en su conformación
  nativa (efecto del pH, sales, solventes,
  temp.)

CD-Visible de proteínas con grupos prostéticos
(cuando el metal se encuentra en ambiente
quiral) Información sobre la interacción
metal-proteína. Resuelve bien transiciones
electrones d-d
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CD de ácidos nucleicos
nativo
Espectro CD (arriba) y de absorción (abajo) de
ADN de E.coli nativo (?), desnaturalizado ( )
y la suma de los deoxinucléotidos
correspondientes ()
desnaturalizado
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CD de ácidos nucleicos
Representación esquemática de los espectros CD-UV
de ADN en varias estructuras secundarias A, B y
C (o Z)
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CD de ácidos nucleicos
CD-UV espectro Polideoxinucléotido GC poli
d(GC).poli d(GC) en distintas estructuras
secundarias B-ADN (), A-ADN ( ) y
Z-ADN (?)
A
B
Z
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El espectro CD de ApG, es la suma de los
monómeros término adicional que considera la
interacción base-base
2qApG(l) qA(l) qG(l) IAG(l)
El espectro CD de ApGpU, es la suma de los
monómeros términos adicionales que consideran
cada interacción base-base
3qApGpU(l) qA(l) qG(l) qU(l)
I'AG(l) I'GU(l) IAU(l)
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• Aplicaciones CD-UV de ácidos nucleicos
• Verificar correcto apareamiento de bases (por
  ej. de una hebra modificada con su hebra
  complementaria)
• Cambios en estructura secundaria con
  temperatura, agentes desnaturalizantes (por ej.
  cálculo de Tm)
• Estudiar isomerizaciones conformacionales
  (helix-coil, B-A, B-Z)