SNP-Genotypisierung

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SNP-Genotypisierung

• SNP Single Nucleotide Polymorphism

99,9 der DNA Sequenzen aller Menschen sind
ident. 80 der verbleibenden 0,1 entsprechen
SNPs. SNP nennt man den Austausch einer
einzelnen Base Bsp. GAACCT wird zu GAGCCT SNP
kommt etwa alle 100-300 bp im Genom vor. Damit
gibt es etwa 10-30 Millionen potentielle SNPs. 4
Millionen sind bereits identifiziert
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Vererbung von SNP

• Meist nicht als einzelne SNPs sondern als Blöcke
  (benachbarte SNPs) vererbt
• Blöcke bezeichnet man als Haplotyp
• Haplotyp Blöcke werden über Generationen ohne
  Rekombination weitervererbt (Stammbaumnachweis,
• Evolutionsnachweis, Populationsstudien)
• Sprich, auch wenn ein Block viele SNPs enthält,
  reicht die Identifizierung einiger SNPs um
  Haplotyp zu identifizieren

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Verbreitete Krankheiten und dazugehörendeSNPs

• Die meisten Krankheiten werden nicht von
  einzelnen SNPs hervorgerufen, sondern durch
  komplexe Interaktionen mehrerer Gene,
  Umweltfaktoren und Lebensstil.
• Zusammenhänge zwischen Krankheit und SNPs bzw.
  Haplotypen werden immer wichtiger für Diagnose.
• Umso mehr Krankheiten bestimmten SNPs/Haplotypen
  zugeordnet werden können, umso einfacher wird
  ihre Diagnose.
• Diagnose durch Analyse spezifischer SNP-Muster

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SNPs und biologische Effekte

• SNPs sind verantwortlich für
• -Beneficial Drug Response
• -Adverse Drug Response

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SNP abhängiger Response

• Mensch und Tier
• Medikamente führen zum gewünschten Erfolg
  Heilung, Repression, Linderung (benef drug resp)
• Medikamente führen zu keiner Besserung oder
  überhaupt zum Tod (adverse drug resp)
• Pflanzen genet. Manipulation von/durch SNPs
  könnte Erntertrag erhöhen
• Vorteil Reduktion von Herbiziden,
  Insektiziden, Kunstdünger
• Bakterien/Viren SNPs verursachen
  Medikamentenresistenz (Krankenhauskeime!!!)
• HIV ist schwer zu behandeln, weil
  Mutationsfrequenz des Virus in den SNPs sehr hoch

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Diagnose von SNPs

• Allel Spezifische (Oligonukleotid) Hybridisierung
  
• Allel Spezifische Oligonukleotid Ligation
• Primer Verlängerung
• Sequenzierung bestimmter DNA-Fragmente

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Allel Spezifische Hybridisierung(AS oder ASO)

• Testprinzip Unterscheidung zweier DNA Moleküle,
  die in einer Base variieren, mittels
  Hybridisierung.
• Floureszenz markierte PCR Produkte werden zu
  immobilisierten Oligonukleotiden (SNP Sequenzen)
  gegeben. Hybridisierung erfolgt extrem stringent
  (was nicht exakt bindet wird weggewaschen).
  Hinterher wird die Intensität der Floureszenz
  gemessen.

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Allel Spezifische Hybridisierung(AS oder ASO)
Zugabe floureszenzmarkierter PCR Produkte zu
immobilisierten Oligos (SNPs), Bindg. sehr
stringent. Floureszenz indirekt prop.
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Allel Spezifische Oligonukleotid Ligation

• Es werden Oligos designt, die komplementär zur
  Zielsequenz (zu untersuchende Sequenz, durch PCR
  hergestellt) sind.
• Am 5oder 3Ende dieses Oligos befindet sich die
  allelspezifische Base
• Liegt ein SNP vor
• Oligonukleotid ligiert nicht an Zielsequenz
• Liegt kein SNP vor
• Oligonukleotid ligiert an Zeilsequenz

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Allel Spezifische Oligonukleotid Ligation
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Primer extension
Das zu untersuchende Gen wird wiederum mittels
PCR amplifiziert Daraufhin folgt eine
Einzelbasen-Sequenzierung Terminatoren
Didesoxynukleotide (verhindert weiteren Anbau von
Basen)
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Allel Spezif. Primer Extension
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Sequenzierung gewisser DNA-Fragmente

• Das Sequenzieren ist meist die Untersuchungsmethod
  e der Wahl bei SNPs
• Zwei Möglichkeiten der Primer Verlängerung
• a) dye-Primers und unmarkierte Terminatoren
• b) Unmarkierte Primer und dye-Terminatoren
• Die Produkte der Reaktion werden dann mittels
  Kapillarelektrophorese aufgetrennt.

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Sequenzierung bestimmter DNA-Fragmente

• 1. Sequenz
• WT homozygot
• 2. Sequenz
• SNP homozygot
• 3. Sequenz
• 1 Allel mit SNP,
• 1 Allel ohne Mutation
• Sequenz zeigt typischen Haplotyp, gleich mehrere
  SNPs als Block nebeneinander!!