Gen

1
Genética y genómica de los desórdenes
hematológicos
2
Índice

• Leucemias
• Clasificación
• Aberraciones cromosómicas
• Rearreglos cromosómicos
• Desregulación génica
• Desequilibrios cromosómicos
• Ganancia de función
• Pérdida de función
• Herramientas genómicas
• Perfil de expresión génica
• Microarreglos
• Aplicaciones
• Diagnóstico
• Pronóstico

3
Genómica

• cancers are typically initiated by acquired
  alterations to the genome of the cancer cell,
  such as chromosomal translocations, mutations,
  and deletions.
• The diagnosis of the hematologic cancers is
  commonly based on morphologic evaluation
  supplemented by analysis of a few molecular
  markers.

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Leucemias

• Grupo heterogéneo de desórdenes neoplásicos de
  los leucocitos.
• De acuerdo a su origen se clasifican en
• Mieloides
• Linfoides
• De acuerdo a su evolución (sin Tx.)
• Agudas
• Crónicas

5
Leucemias

• Leucemia linfocítica crónica (LLC) expansión
  monoclonas de linfocitos (95 linfos B).
• Leucemia linfoblástica aguda (LLA) Desorden
  monoclonal maligno de los precursores
  linfopoyéticos.
• Leucemia mieloide crónica (LMC) proliferación no
  controlada de granulocitos
• Leucemia mieloide aguda (LMA) Trastorno de los
  precursores de celulas hematopoyéticas. De
  acuerdo al sistema francés- americano-británico
  se sub-dividen en 6 grupos.

6
(No Transcript)
7
Etiología

• La causa de la expansión clonal no se conoce
  totalmente.
• Involucra algunos re-arreglos de ADN.
• Factores externos agentes alquilantes,
  medicamentos, radiaciones ionizantes y
  substancias químicas.
• Factores internos Anormalidades cromosómicas que
  dan lugar a cambios en el ADN.

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Etiología

• Sd. de inestabilidad cromosómica
• Anemia de Fanconi
• Sd. mielodisplásico
• Leucemia mieloide aguda
• Sd. de Bloom

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Agentes que producen Aberraciones cromosómicas

• Tx con agentes alquilantes
• Se asocian a anomalías cromosómicas No
  balanceadas.
• Pérdidas o deleción de Cr. 5 o 7 o ambos.
• Síndrome mielodisplásico y leucemia mieloide
  aguda.
• Tx con inhibidores de Topoisomerasa II
• Se asocian a anomalías balanceadas
• Traslocaciones 11q23.1 (gen MLL)
• LLA.

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Anormalidades cromosómicas

• Los rearreglos cromosómicos pueden dar lugar a
  alteración en la estructura o regulación de
  oncogenes.
• Se consideran eventos iniciales en la
  carcinogénesis Principales clases de anomalías
  cromosómicas
• Rearreglos cromosómicos balanceados
• Rearreglos No balanceados
• Translocaciones recíprocas
• Inversiones
• Inserciones

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Rearreglos cromosómicos Balanceados

• Re-arreglos cromosómicos balanceados dan lugar a
• Formación de quimeras por fusión génica.
• Resulta en la expresión de una proteína quimérica
  con una actividad nueva o alterada.
• Cambios cromosómicos que producen desregulación
  de un gen estructuralmente normal.
• Da lugar a la expresión des-regulada de una
  proteína normal.

12
Chromosomal Abnormalities in Human Cancer
13
Rearreglos y genes

• Algunas translocaciones asociadas a leucemia en
  la infancia aparecen in útero.
• Los re-arreglos Cr. están asociados a genes
  específicos (MLL, ETV6, y NUP98) que se
  encuentran en estados patológiocs específicos.
• BCR-ABL1 es un gen resultado de una fusión que
  sirve para evaluar respuesta a Tx. de cáncer.

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Fusión quimérica de genes

• Genes que participan en la formación de una
  quimera
• Tirosin quinasas
• Factores de trascripción.
• El cromosoma Filadelfia resulta de la formación
  de un gen fusionado quimérico.
• El cromosoma 22 truncado está presente en
• Casi todos los pacientes con leucemia mieloide
  crónica (LMC).
• 20 de los pacientes con leucemia linfoblástica
  aguda (LLA).
• Raros casos de leucemia mieloide aguda (LMA).

15
Cromosoma Filadelfia

• Translocación recíproca t(922)(q34.1q11.23)
• Las secuencias del gen BCR en la banda 22q11.23,
  se unen a las porciones del gen que codifica para
  la tirosin quinasa citoplásmica ABL1 en la banda
  9q34.1

16
CR Filadelfia

• En1973 Rowley observó que el cromosoma Ph era el
  resultado de una traslocación recíproca que
  involucraba también el cromosoma 9.
• La anormalidad se conoce como t(922)(q34q11).
• En 1980 se demostró que el cromosoma Ph tenía un
  gen con una fusión denominada BCR-ABL.
• Se piensa que esta es la principal causa de la
  fase crónica de la LMC.

17
Rearreglos en Leucemias. Cr Filadelfia

• Leucemia mieloide crónica (LMC) y Leucemia
  linfoblástica aguda (LLA)
• El rearreglo t(922)(q34.1q11.23) da lugar a la
  expresión de una proteína quimérica con actividad
  de tirosin quinasa, en ausencia de las señales
  fisiológicas de activación.
• El cromosoma Filadelfia es el resulatdo de esta
  translocación.
• Las secuencias de BCR en el gen de la banda
  22q11.23 se fusiona a la parte del gen que
  codifica a la tirosin quinasa citoplásmica
  localizado en la banda 9q34.1.

18
The t(922) Translocation and Its Products the
BCR-ABL Oncogene on the Ph Chromosome and the
Reciprocal ABL-BCR on the Derivative 9q
Chromosome
19
Functional Consequences of Balanced Chromosomal
Rearrangements
20
Aberraciones cromosómicas Aplicación de su
conocimiento

• Demuestran que los cánceres en humanos pueden
  aparecer por alteraciones genéticas adquiridas en
  las células somáticas
• La señal de tirosin-quinasa aberrante en la LMC
  dio lugar a el uso de inhibidores selectivos
  Imatinib mesilato.
• Las mutaciones de los dominios de quinasa
  resistentes a imatinib son responsables de la
  mayor parte de los casos de recaída.
• Una nueva generación de medicamentos ha sido
  desarrollada (dasatinib and nilotinib).

21
Moléculas blanco Imatinib
Leucemia mieloide crónica
BCR
ABL
BCR-ABL es una tirosin quinasa funcional
autónoma ? Proloferación irregular
22
CONSTITUCION CROMOSOMICA NORMAL
23
Paciente femenina de 64 años con Dx. de
LMC Primera muestra
24
Paciente femenina de 64 años con Dx. de
LMC Primera muestra
46,XX,t(922)(q34q11.2 14/ Hiperdiploidía
mayor de 90 cromosomas 6
25
Importancia de los estudios

• Utilidad del análisis cromosómico convencional
  para el desarrollo de nuevos Tx antineoplásicos.
• Citogenética molecular (FISH) permite la ID de
  rearreglos genómicos que ayuda al desarrollo de
  nuevos medicamentos.

26
Selected Examples of Chromosomal Rearrangements
27
Genes de Factores de Transcripción

• Los rearreglos cromosómicos que alteran los genes
  de F. de T dan por resultado
• Proteínas de fusión con actividad transcripcional
  aberrante o aumentada.
• En LMA La proteína quimérica PML-RARA
• Proteínas de fusión que median la represión
  transcripcional.

28
Genes de Factores de Transcripción

• Chromosomal rearrangements that entail aberrant
  transcriptional repression occur in a substantial
  proportion of patients with acute myeloid
  leukemia.38 For example, the chimeric proteins
  resulting from fusion genes such as PML-RARA

29

• Las proteínas de fusión asociadas a represión
  transcripcional son blanco Tx.
• El ácido retinóico y el trióxido de arsénico
  revierten la represión transcripcional causada
  por la proteína de fusión PML-RARA
• Ambos medicamentos son efectivos en el Tx de
  leucema promielocítica.

30
(No Transcript)
31
Cytogenetic Abnormalities Leading to the
Expression of Deregulated Tyrosine Kinases in
Chronic Myeloproliferative Disorders
32

• Estudio citogenético
• Citogenética Molecular
• FISH

33
Citogenética/ Molecular

• Ha permitido la ID de la fusión del gen ABL1 al
  gen NUP214 en la banda 9q34.
• Presente en el 5 de adultos con Leucemia
  linfoblástica aguda de células T
• Sensible a Imatinib
• La fusión es episomal.
• (elementos extracromsómicos no detectables por
  análisis citogenético convencional.

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Desequilibrios Cromosómicos

• Pueden ser por ganancia o pérdida de material
  genéticoLas ganancias genómicas incluyen
• Trisomías parciales o incompletas
• Amplificaciones
• Intracromosómicas (regiones homogéneamente
  teñidas sin patrones de bandeo)
• Extracromosómicas (cromosomas double-minute, ADN
  autónomo, acéntrico de tamaño variable).

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Desequilibrios Cromosómicos.

• Las pérdidas genómicas incluyen
• Monosomías
• Deleciones
• Grandes
• Sub-microscópicas
• La causa de anomalías cromosómicas no es
  conocida.
• Estudios en varios tipos de leucemias han
  demostrado que exposiciones ambientales y
  ocupacionales y Tx con medicamentos citotóxicos
  pueden inducir aberraciones cromosómicas.

36
(No Transcript)
37
Utilidad de los marcadores citogenéticos.

• Diagnóstico
• Anormalidades cromosómicas asociadas a ciertos
  tipos de leucemias
• Respuesta al tratamiento
• Rearreglos cromosómicos como el gen fusión
  BCR-ABL1 son indicadores sensibles en la
  evaluación de la evolución del cáncer.

38
Aplicaciones

• El análisis de las anormalidades cromosómicas se
  puede utilizar para identificar sub-poblaciones
  de pacientes con un mayor beneficio de un Tx
  particular.

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Desregulación de expresión

• Los rearreglos que se yuxtaponen a elementos
  regulatorios tejido específicos (genes
  promotores o secuencias aumentadoras) en la
  secuencia codificante de un proto-oncogen
  desregulan su expresión.

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Desequilibrios cromosómicos

• Pueden ser
• Alteraciones en todo el gen
• Duplicaciones o deleciones intragénicas
• A diferencia de los rearreglos, las consecuencias
  funcionales de los desequilibrios no se conocen.
• Las consecuencias de los rearreglos pueden ser
  identificados por sus sitios de ruptura.

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Técnicas de estudio

• Desequilibrio de regiones cromosómicas grandes
  contienen muchos genes.
• Tumores presentan anomalías cr desbalanceadas
• La integración de estudios genómcios completos,
  perfil de expresión génica, técnicas de genómica
  funcional permiten la id de genes importantes
  dentro de regiones genómicas afectadas por
  anomalías cromosómicas.

42
Ganancias genómicas

• Contribuyen a la genesis del cáncer
• Incrementan la actividad de genes especiçíficos
  en las regiones cromosómicas afectadas.
• Algunos genes codifican para proteínas que pueden
  ser blanco de nuevos esquemas terapéuticos.
• 30 de las mujeres con Ca de mama presentan
  amplificación del gen ERBB2 (receptor de tirosisn
  cinasa) ubicado en la banda 17q21.1
• Esta molécula es blanco del trastuzumab,
  anticuerpo monoclonal utilizado en el Tx.

43
Ganancias genómicas a gran escala

• Aparecen por no disyunción o por traslocaciones
  desbalanceadas, generando trisomías compleats o
  parciales, por eventos de amlificación afctando
  segmentos de DNA de tamaño diverso
• Ha permitido descubrir nuevos oncogenes.

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Pérdidas genómicas a gran escala

• Deleciones extensas afectan múltiples genes.
• Se dificulta Id cual pérdida génica se asocia al
  desarrollo de la neoplasia
• Genes candidatos de dichas regiones son
  analizados para deleciones, mutaciones, o
  modificaciones epigenéticas que inactivan el
  alelo restante.

45
Ganancias focales

• Variaciones en el número de copias se han
  identificado por tamizaje de genomas tumorales.
• Métodos de alta resolución
• Hibridación genómica comparativa (CGH)
• Polimorfimos de un solo nucleótido (SNP)
• Arreglos de CGH y de SNP

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Pérdidas genómicas

• Van desde alteraciones visibles por citogenética
  (monosomías parciales o completas) hasta
  deleciones intragénicas o de un solo gen.
• Su contribución a la transformación maligna puede
  ser por la reducción de la función de genes
  específicos en las regiones cromosómicas
  afectadas.
• Las técnicas genómicas modernas han permitido la
  identificación de nuevos genes supresores
  tumorales que actúan a través de insuficiecia
  alélica y el descubrimiento de genes no
  codificantes

47
Pérdidas genómicas

• Deleciones con valor pronóstico y decisión Tx.
• del(5q) en LMA
• del(11q), del(13q), y del (17p) en LLC

48
Arreglos de SNP

• Útiles en el descubriemiento de genes asociados a
  pérdidas genómicas.
• Aprox. 30 de niños con LLA (células B)
• del (9p13) PAX5
• Más del 80 de pacientes con LLA BCR-ABL
  positivos
• del(7p13-p11.1) IKZF1

49
Pérdidas genómicas con insuficiencia alélica

• Se utiliza el RNA de interferencia
• ID de gen causal de síndrome mielodisplásico (5q
  menos) RPS14 .
• Pérdida de 1.5-Mb en 5q32.
• Estos pacientes responden muy bien a un derivado
  de talidomida (lenalidomide).

50
Pérdidas genómicas de genes no codificantes

• Pérdidas cromosómicas asociadas a cáncer que
  actúan mediante la inactivación de genes no
  codificantes de proteínas
• Contienen genes de microRNAs asociados a
  regulación pos transcripcional de la expresión
  génica.
• Micro RNAs con actividad suresora tumoral.

51
Pérdidas genómicas de genes no codificantes

• 50 de los pacientes con LLC tienen deleción de
  un segmento en 13q14.3.
• Este contiene los genes MIRN15A y MIRN16-1
• Los genes MIRN15A y MIRN16-1 regulan
  negativamente la expresión de la proteína BCL2.93
  (apoptótica).

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Proteína quimérica aberrante

• Los rearreglos que dan lugar a la expresión de
  una proteína quimérica con actividad
  aberrantemente aumentada están representados por
  la traslocación t(1122)(q24.1-q24.3q12.2)
  asociada al sarcoma de Ewing

53
Prónostico

• Transplante de células madre es importante en el
  Tx de LMA.
• Se debe evitar si se tiene un patrón citogenético
  asociad a buen pronóstico
• Traslocaciones t(821) y t(1616)
• Inversiones inv(16)
• Se debe considerar el transplante en pacientes
  con anomalías citogenéticas asociadas a recaídas
  después de quimioterapia.

54
Pronóstico

• Genotipos de bajo riesgo, asociados a recaída en
  el 35 de los casos, en pacientes con
  citogenético normal.
• Presencia de mutaciones favorables
• Gen del F. de T. CEBPA
• Gen de nucleofosomina (NPM1)
• Ausencia de duplicaciones en tandem internas
  desfavorables en el gen tirocin cinasa 3 asociado
  a fms (FLT3-ITD).

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Micro RNAs en LMA

• Los microRNA son pequeós segmentos de RNA de una
  sola cadena (19-25 nucleótidos) .
• Hay estudios que muestran perfiles de expresión
  de microRNAs característicos en sub tipos de LMA
  citogenética y molecularmente definidos.
• Los perfiles de expresión de microRNAs tienen
  valor pronóstico independiente de la influencia
  de la mutación de FLT3-ITD.

56
MicroRNAs

• Hay un grupo de 12 secencias de microRNAs que
  distinguen 2 subgrupos de LMA citogenéticamente
  normal.
• Uno con probabilidad de sobrevida libre de
  enfermedad de 11 y otro con 36 de probabilidad.
  
• LMA con genotipo FLT3-ITD y NPM1 silvestre y
  ausencia de FLT3-ITD.
• Ambos fenotipos comstituyen el 60 de los casos
  de LMA.

57
Estimated Frequency of Specific Genotypes of ALL
in Children and Adults
Pui C et al. N Engl J Med 20043501535-1548
58
The AML1-CBFbeta Transcription Factor
Lowenberg B et al. N Engl J Med 19993411051-1062
59
Desequilibrio cromosómico

• Leucemia mieloide aguda
• amp(13) (q12.3) CDX2
• amp(21)(q22.3) ERG
• del(5q)?
• del(7q)?
• del(20q)?
• del(12)(p13) EPV6
• Leucemia mielocítica crónica
• del(7)(p13-p11.1) fase blástica
• Leucemia linfoblástica aguda
• del(12)(p13) EPV6
• del(7)(p13-p11.1) (BCR/ABL1 pos)

60
Probability of Survival from the Date of
Diagnosis among the Patients in the Five Genetic
Categories
Dohner H et al. N Engl J Med 20003431910-1916
61
Perfiles de expresió

• Gene-expression profiling is a genomics technique
  that has proved effective in deciphering this
  biologic and clinical diversity. The approach
  relies on the fact that only a

62
CGH
63
(No Transcript)
64
Examples of Chromosome Banding, Interphase
Fluorescence in Situ Hybridization, Spectral
Karyotyping, and Array-Based Comparative Genomic
Hybridization
65
Because we know more specific information, we can
Diagnose more precisely Provide more effective treatment.
Select specific treatment that best fits disease Target the medication to the disorder. Avoid adverse drug reactions. Avoid delay from false starts.
Predict risk before symptoms occur Provide earlier treatment. Take preventive action.
Manage disease more effectively Eliminate unnecessary treatment. Provide better timing. Adjust treatment as disease changes.
AND
AND
AND
AND
66
Diagnóstico
Las pruebas genéticas que ID mutaciones del DNA
en leucemias infantiles permiten la selección de
tratamientos más específicos
Impacto de las pruebas genéticas y Tx basados en
el genoma en la sobrevida de niños con leucemia

• LLA es la más común en niños.
• Las pruebas genéticas permiten la ID de subtipos
  y permiten la admon. De Tx específicos
• Actulmente la tasa de curación es mayor del 80
  contra 4 en los años 60s.

Source New England Journal of Medicine, 2006,
200l Personalized Medicine Coalition, 2006.
67
(No Transcript)
68
(No Transcript)
69
(No Transcript)
70
Comparative Genomic Hybridization
71
Selección de Tx específicos

• La traslocación 9 22 que da por resultado el
  gen fusión de BCR/ABL se conoce como Cromosoma
  Filadelfia el cual es carácterístico de la
  Leucemia mieloide aguda.

72
(No Transcript)
73
(No Transcript)
74
Today, Cancer is experiencing a shift toward
precision medicine
Farber develops 1st chemotherapy for leukemia
Novartis launches Gleevec, the 1st molecular
targeted drug, to treat myeloid leukemia
2 types leukemia lymphoma
1920
1930
1940
1950
1960
1970
1980
1990
2000
2010
Disease of the blood
38 types of leukemia 51 types of lymphoma
3 types of leukemia (acute, chronic, preleukemia)
and 2 types of lymphoma (indolent, aggressive)
Source Mara Aspinall, Genzyme
75
Genetic tests identify variations in the BRCA 1
and BRCA 2 genes that increase risks for breast
and ovarian cancer.
Predict Risk of Disease Before Symptoms

• Genetic tests identify greatly increased
  hereditary risk for breast and ovarian cancer
• Knowledge of increased risk allows preventive
  measures, such as closer monitoring, risk
  avoidance, and preventive surgery or chemotherapy

Lifetime risk of developing breast cancer
with BRCA 1 and 2 50 - 85
.without 13
Lifetime risk of developing ovarian cancer
with BRCA 1 and 2 10 - 45
without 1.7
76
Molecular diagnostics is at the core of the
personalized medicine vision
Diseases will be diagnosed long before the
patient begins to manifest any evidence using
traditional tools
Molecular Diagnostics