RNA silencing:

1
RNA silencing

• Small RNAs as Ubiquitous Regulators of Gene
  Expression

2
Skematisk opdeling af små RNAer

• Box 1. A guide to 2125nt RNAs.
• Short interfering (si)RNA
• Double stranded with 3 overhangs of two
  nucleotides
• Perfectly complementary to target RNA
• Directs endonucleolytic cleavage
• Precursor
• Perfect or nearly perfect RNA duplex
• Chromosomal or cytoplasmic
• 25 base pairs in length
• Micro (mi)RNA
• Single stranded
• Partially complementary to target RNA
• Unknown mechanism of action
• Often conserved between species or even across
  phyla
• Precursor
• Bulged, partially double-stranded RNA
• Chromosomal (IGR)
• 70 nucleotides in length

3
Skematisk opdeling af små RNAer fortsat

• Short temporal (st)RNA
• Single stranded
• Partially complementary to target RNA
• Inhibits translation initiation
• Highly conserved between species and across phyla
• Precursor
• Bulged, partially double-stranded RNA
• Chromosomal (IGR)
• 70 nucleotides in length

4
Biologiske effekter af små ikke-kodende RNAers
silencing aktivitet

• Beskyttelse af genomet mod mobile DNA elementer
• Antiviralt forsvar mange hvilke producerer
  dsRNAer i replikationsprocessen
• Regulering af eget genom
• Formation af konstitutivt heterokromatin fx set i
  centromer- og telomer-regioner

5
Short temporal RNAs (stRNA) i C.elegans

• Eksempler lin-4 og let-7
• De koder ikke for proteiner og udtrykkes i
  specifikke larvestadier
• Deres sekvenser complementerer 3 UTRs af flere
  target mRNAer involveret i developmental-timing
  pathways kendte for effekt på translationseffekti
  vitet og transkriptstabilitet
• Ekspression af lin-4 og let-7 sammenfalder med
  repression af disse mRNAer
• og Repressionen menes at igangsættes af
  base-parring mellem stRNA dens target-mRNA

6
stRNAer i C. elegans fortsat

• Effekt af loss-off-function mutationer ændret
  celledeling og cell-fate determinering
• 22 nt lange
• Dannet udfra ca. 70 nt lange, delvist ds, bulede
  hårnåle-strukturerede precursor RNAer
• DCR-1aktivitets-knockout resulterer i samme
  fænotyper som lin-4 og let-7-mutanter. RNAi er
  sandsynligvis krævet for modning af
  stRNA-precursoren
• lin-4 og let-7 loci er placeret intergenic
  regions (IGR) og har ingen ORFs (dette gælder
  alle små RNAers loci)

7
stRNAer i C. elegans fortsat

• Eksempler på target er regioner med
  retrotransposon LTRs, hvor flere nærliggende
  meiotiske gener represseres.
• LTRs har derfor muligvis en regulerende effekt på
  gen-ekspression ved cellulær differentiering
• Typisk karaktertræk i de represserede områder er
  hypermethylering og hypoacethylering af DNA i
  specifikke mønstre
• Ødelæggelse af mønsteret sammenfalder med
  mobilisering af transposons. Bekræfter
  transposons represserende rolle.

8
RNAi (interference)-systemet

• RISC RNA-induced silencing complex, afgørende
  rolle i modning af små ikke-kodende RNAer
• Tre vigtige og evolutionært konserverede gener er
  (navnene er fra S. pombe)
• ago1, som er en del af RISC (Argonaute)
• Dcr1, en RNAaseIII helicase (Dicer)
• Rdp1, RNA-directed RNA polymerase (RdRP)
• Analoger af disse gener er fundet i bl.a.
  Arabidopsis, ris, C. elegans og Drosophila

9
stRNA pathway i C. elegans
10
Micro RNAs (miRNA) i dyr

• miRNAer danner ikke perfekte Watson-Crick-hybrider
  med deres target mRNAer
• miRNA er kodet af egne gener og regulerer gener
  forskellige fra disse
• Mange targets er faktorer, der kontrollerer
  processer involveret i developmentale og
  fysiologiske processer og er ofte
  transkriptionsfaktorer
• RNAi og Dicer-analoger er krævet for modning af
  miRNA fra ca. 70 nt precursor med hårnåle-struktur

11
miRNAer i dyr (fortsat)

• Precursor dannes fra et længere transcript kaldet
  pri-miRNA.Dette sker i nucleus.
• Pre-miRNA fungerer så som substrat for nuclear
  transport, og i cytoplasma dannes mi-RNA fra
  pre-miRNA
• Nogle miRNA-gener ligger tæt sammen, hvilket
  foreslår, de er transkriberede som et
  polycistronisk transkript, der potentielt
  tillader deres koordinerede regulering og effekt
• Størstedel af locierne er placeret i IGR eller
  introns og udtrykkes som uafhængige transkripter

12
miRNAer i dyr (fortsat)

• targets findes som ved stRNAer bla. i regioner
  med retrotransposon LTRs hvor flere nærliggende
  meiotiske gener represseres og i UTR-motiver som
  har effekt på translationseffektivitet og
  transkriptstabilitet.
• LTRs har derfor muligvis en regulerende effekt på
  gen-ekspression ved cellulær differentiering
• Typisk karaktertræk i de represserede områder er
  hypermethylering og hypoacethylering af DNA i
  specifikke mønstre (TGS)

13
miRNAer i dyr (fortsat)

• Ødelæggelse af mønsteret sammenfalder med
  mobilisering af transposons. Bekræfter
  transposons represserende rolle.
• Pga. effekten af LTR synes det muligt at effekten
  af miRNA og RNAi ikke kun er target
  mRNA-degradering (PTGS) men også også TGS via fx
  DNA- eller histon-modifikationer som det ses ved
  siRNAer

14
(No Transcript)
15
Short interfering RNAs (siRNA) i S. pombe

• siRNAer medierer silencing i trans af de samme
  (eller meget lig) gener, som de oprinder fra.
  Dvs. de laver perfekt (eller næsten) baseparring
  med target
• Dannes udfra gt 25 nt precursor-mRNA. I
  hårnålestruktur eller som ds RNA dannet fra
  transkription af både sense og antisense-streng
• RISC og en histon methyltransferase (CLR4) er
  krævet for dannelse af i hvert tilfælde nogle af
  siRNAer
• De er dobbeltstrengede indtil de bliver delt i
  RISC

16
SiRNA i S.pombe fortsat

• Generne (og derfor også targets) er fundet i
  områder med repetitivt satellit-DNA og
  transposable elementer med LTRs i fx telomerer,
  centromerer og Mating type-region regioner med
  konstitutivt heterokromatin

17
siRNAer i S.pombe fortsat

• Typisk karaktertræk i de represserede områder er
  hypermethylering og hypoacethylering af histoner
  i specifikke mønstre (histone code). Ødelæggelse
  af mønsteret sammenfalder med mobilisering af
  transposons. Bekræfter transposons represserende
  rolle.

18
SiRNA i S.pombe fortsat

• Fra generne dannes overlappende transkripter
• siRNA kan kun dirigere og initiere silencing ikke
  sprede denne. Til dette kræves andre faktorer
  bla. Swi6, Clr3-6 og igen Clr4
• Der er fundet lignende sammenhænge mellem
  gen-silencing-mekanismer, retrotransposon-silencin
  g og centromerisk satellit-repeat heterokromatin
  i pattedyr. Om RNAi er involveret vides ikke

19
siRNA pathway i S.pombe
20
(No Transcript)
21
Endogene små RNAer i planter der ligner dyrs
siRNAer mest

• Mange og diverse former i forhold til små RNAer i
  dyr
• En lille RNA kan have flere targets Potentiel
  regulering af flere gener samtidigt via simpelt
  system
• Langt størstedelen af de små RNA-gener er fundet
  i IGR og transkriberes uafhængigt
• De små RNA udviser vævsspecifik akkumulering,
  hvilket tyder på kompositionen af disse er unik i
  forskellige celle- og vævstyper

22
Endogene små RNAer i planter der ligner dyrs
siRNAer mest

• Fra generne sker en overlappende transkiption
  (små RNA-sekvenser overlapper). Dette ses kun hos
  siRNA hos dyr
• De små RNAer forkommer i både sense- og
  antisense-orientering (også kun hos siRNA hos
  dyr). Andre små RNAer forkommer kun i
  sense-orientering
• Der er perfekt baseparing mellem RNA og target og
  har derfor effekt på eget eller meget nært
  beslægtede gener (også kun hos siRNA hos dyr)

23
Endogene små RNAer i planter der ligner dyrs
siRNAer mest

• Plante-RNAers precursors er mere heterogene end
  dyrs men har også hårnåle-strukturer
• Targets er både i nontransposon proteinkodende
  gener og
• Proteinkodende gener fra LTR, non-LTR
  retrotransposons og transposons

24
Små RNAer i planter med fællestræk til
dyre-miRNAer

• Gener fundet i IGR og protein-kodende gener
• De udtrykkes i forskellige udviklingsstadier
• Dicer-analog (CAF) fundet værende nødvendig for
  miRNAs effekt. Tilhørende familie af fire
  proteiner, som alle har a.a. domæner
  karakteristiske for Drosophila-DICER.

25
Små RNAer i planter med fællestræk til
dyre-miRNAer

• CAF er impliceret i stamcelle-skæbne
• Analogien antyder en lignende mekanisme i
  planter
• Targets er UTR, splice sites, regioner af kodende
  mRNAer og promoter-regioner

26
Små RNAers regulering af gen-ekspression hos
planter
27
Yderligere kompleksitetsmå RNAer i forskellige
str.klasser

• To str.klasser af siRNAer fundet i Arabidopsis.
• Lange (24-26 nt). Behøves for systemisk
  (celle-celle) silencing i Nicotiana benthamiana
  og methylering af retroelement i Arabidopsis
• Lange siRNAer er unødvendige for mRNA-degradering

28
Yderligere kompleksitetsmå RNAer i forskellige
str.klasser

• Korte (21-22 nt) siRNAer behøves for mRNA-
  degradering
• Korte siRNA er unødvendige for effekterne set for
  de lange siRNAer
• Forskellige str. foreslår forskellige
  Dicer-analoger med fx specifikke subcellulære
  lokaliseringer. Forskellige str. siRNA deltager i
  forskellige grene af RNA-silencing pathway

29
Yderligere kompleksitet epigenetisk kontrol

• Lange siRNAer involveret i retrotransposon-methyle
  ring kan blive produceret af en nuclear
  Dicer-homolog

30
Konklusion

• Som Peter sagde
• Amerikanernes definition af ikke-kodende RNA
  som værende noget junk har intet på sig!

31
(No Transcript)