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LA%20M

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manation du cytosquelette : microtubules prot ines associ es ... Together these complexes recruit multiple discrete protein complexes, ultimately ... – PowerPoint PPT presentation

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Title: LA%20M


1
LA MƉCANIQUE DE LA DIVISION CELLULAIRE
2
Plan
  • I - Vue gĆ©nĆ©rale de la phase M
  • II - Mitose
  • III - CytocinĆØse

3
II Mitose
4
Mitose fuseau mitotique
  • Ɖmanation du cytosquelette microtubules
    protƩines associƩes
  • SĆ©paration des chromosomes filles vers les pĆ“les
  • Ecartement des pĆ“les

5
2 ƩvƩnements
  • Fuseau dans le cytoplasme
  • Condensation des chromosomes dans le noyau
  • PromĆ©taphase mĆ©lange des deux compartiments ?

6
Les microtubules
  • Capturent les chromosomes
  • Intervention des moteurs
  • Proches des extrĆ©mitĆ©s des microtubules
  • Famille des kinĆ©sines ( ? extrĆ©mitĆ© )
  • Famille des dynĆ©ines ( ? extrĆ©mitĆ© -)
  • ExtrĆ©mitĆ©s des microtubules
  • Site dassemblage et de dĆ©sassemblage des
    microtubules
  • Lieu de production de force
  • Fuseau
  • Ɖquilibre entre les deux forces opposĆ©es (moteurs
    et moteurs -)

7
Les trois classes de microtubules
  • MT astraux
  • Irradient dans toutes les directions
  • SĆ©paration des pĆ“les
  • PoignĆ©es dorientation et de positionnement du
    fuseau dans la cellule
  • MT du kinĆ©tochore
  • LiĆ©s au kinĆ©tochore
  • Fixent les chromosomes au fuseau
  • MT chevauchant (polaires)
  • SymĆ©trie bipolaire du fuseau

8
Fig 18-10
  • Les trois classes de microtubules
  • MT astraux
  • MT du kinĆ©tochore
  • MT chevauchant (polaires)
  • Toutes les extrĆ©mitĆ©s sont vers le centrosome

9
Rappel sur les microtubules interphasiques
  • RĆ©seau de microtubules Ć©manant du centrosome
  • InstabilitĆ© dynamique
  • Croissance ? raccourcissement catastrophe
  • Raccourcissement ? Croissance restauration

10
Plan
  • Prophase
  • Modification de la stabilitĆ© des microtubules
    Ć©quilibre MAPs ? catastrophines
  • Assemblage du fuseau Ć©quilibre moteurs Ć 
    direction ? moteurs Ć  direction -
  • PromĆ©taphase
  • MĆ©taphase
  • Anaphase
  • TĆ©lophase

11
A Prophase
  1. Modification de la stabilitƩ des microtubules
    Ć©quilibre MAPs ? catastrophines
  2. Assemblage du fuseau Ć©quilibre moteurs Ć 
    direction ? moteurs Ć  direction -

12
1 - Modification de la stabilitƩ des microtubules
Ć©quilibre MAPs ? catastrophines
13
Changement brutal des microtubules en prophase
le constat
  • Longs et peu nombreux (interphase) ?
  • Plus nombreux et plus courts
  • Effondrement de la demi-vie des microtubules
  • Augmentation de linstabilitĆ© des microtubules
  • Augmentation du nombre de microtubules irradiant
    du centrosome
  • Par modification des centrosomes qui augmentent
    leur taux de nuclƩation

14
Fig 18-11
  • Les microtubules mitotiques sont diffĆ©rents des
    microtubules interphasiques

15
Protocole dƩtude
  • Cellule en culture (lignĆ©e PTK1 et BSC) injectĆ©e
    avec tubuline-fluorochrome (dichlorotriazinyl-amin
    ofluorescein (DTAF-tubulin))
  • Irradiation avec un rayon laser dune petite
    surface jusqu'Ć  extinction de la fluorescence
  • Evaluation de la rĆ©apparition de la fluorescence
    en fonction du temps

16
Saxton, WM J Cell Biol 992175, 1984
  • FIGURE 8 Comparison of FRAP rates for a metaphase
    and an interphase cell. Examples of relative
    fluorescence intensity plotted against time after
    photobleaching for a metaphase cell (?) and an
    interphase cell (?). Circles represent data
    points determined by microdensitometry of
    negatives. Lines represent best fitting curves
    using the function l/lmax 1 e kt (30). The
    tĀ½ for each curve is noted on the X axis.

17
Changement brutal des microtubules en prophase
mƩcanisme de dƩclenchement en dƩbut de mitose
  • M-Cdk phosphoryle
  • Des moteurs protĆ©iques
  • Des MAPs (Microtubule Associated Proteins) (leur
    phosphorylation ? diminution de la stabilitƩ des
    microtubules)
  • ? contrĆ“le de la dynamique des microtubules
  • DĆ©monstration par biochimie chez Xenopus

18
Xenopus
  • Extrait dœuf de Xenopus en phase M ou en
    interphase
  • Centrosome tubuline fluorescente ?
  • NuclĆ©ation des microtubules Ć  partir des
    centrosomes
  • (Analyse en vidĆ©o microscopie Ć  fluorescence
    time-lapse )
  • Mais 1p1038
  • Extraits mitotiques ? taux trĆØs Ć©levĆ© de
    catastrophes
  • Extraits interphasique ? taux plus bas de
    catastrophes

19
Les catastrophines
  • ProtĆ©ines
  • Augmentent la frĆ©quence des catastrophes

20
Les catastrophines
21
Fig 16-55
  • KinĆ©sines et Kinesin-related proteins
  • KIF2
  • moteur au milieu de la chaĆ®ne lourde
  • pas d'activitĆ© moteur classique
  • se lie aux extrĆ©mitĆ©s des microtubules pour
    augmenter leur instabilitƩ dynamique ? nom de
    catastrophine

22
Antagonisme catastrophines / MAPs
23
Antagonisme catastrophines / MAPs
  • Microtubules plus dynamiques en phase M
  • Par action sur catastrophines et MAPs ?
  • Augmentation du taux de dĆ©polymĆ©risation des
    microtubules (catastrophines)
  • Diminution du taux de dĆ©polymĆ©risation des
    microtubules (MAPs)
  • Augmentation et diminution du taux de
    dƩpolymƩrisation des microtubules

24
Fig 18-12(A)
  • ContrĆ“le de la longueur des microtubules par
    l'Ć©quilibre entre catastrophines et MAPs

Catastrophes avec extraits mitotiques gt
catastrophes avec extraits interphasiques
25
Fig 18-12(B)
  • Centrosomes et noyaux de spermatozoĆÆdes dans des
    extraits mitotiques
  • Extraits mitotiques normaux ? fuseau normal
  • DĆ©plĆ©tion en XMAP215 ? fuseau trĆØs anormal
  • Probablement parce que les microtubules nuclĆ©Ć©s
    par les centrosomes sont trop courts

Mitose dans un extrait normal
Mitose dans un extrait dƩplƩte en XMAP215
26
RĆ©gis Tournebize, Andrei Popov, Kazuhisa
Kinoshita, Anthony J. Ashford, Sonja Rybina,
Andrei Pozniakovsky, Thomas U. Mayer, Claire E.
Walczak, Eric Karsenti Ā Anthony A. Hyman Control
of microtubule dynamics by the antagonistic
activities of XMAP215 and XKCM1 in Xenopus egg
extractsNature Cell Biology Ā 2, 13 - 19 (2000)
  • Spindle formation observed in control and
    XMAP215-depleted extracts. Microtubule arrays
    are seen in control (left) and XMAP215-depleted
    (right) extracts 20 and 45 min after addition of
    sperm nuclei. Spindles are seen 45 min after
    sperm addition. Scale bar represents 10 Āµm.

20 mn
20 mn
45 mn
45 mn
Les fuseaux deviennent visibles 45 min aprĆØs
lajout des spermatozoĆÆdes
27
2 - Assemblage du fuseau Ć©quilibre moteurs Ć 
direction ? moteurs Ć  direction
28
PropriƩtƩs des microtubules
  • Si monomĆ©rique le moteur se dĆ©place
  • Si multimĆ©rique liaison de 2 microtubules
    adjacents qui peuvent se dƩplacer lun par
    rapport Ć  lautre
  • GĆ©nĆ©ration de foyers Ć  extrĆ©mitĆ©s moins ? pĆ“les
    du fuseau
  • Glissement de microtubuleslun par rapport Ć 
    lautre ?zone de chevauchement dansle fuseau

29
Fig 18-13
  • Importance des moteurs multimĆ©riques pour
  • Assemblage
  • fonctionnement des microtubules

30
Assemblage du fuseau Ć©quilibre
  • Croissance de microtubules Ć  partir de chaque
    centrosome ? les microtubules ont des polaritƩs
    opposƩes
  • Association de moteurs Ć  dĆ©placement ?
  • Ɖcartent les centrosomes
  • Des moteurs Ć  dĆ©placement - ?
  • Rapprochent les centrosomes
  • Formation du fuseau Ć©quilibre entre les deux

31
Fig 18-14
  • Prophase sĆ©paration des pĆ“les du fuseau grĆ¢ce Ć 
  • des moteurs (kinĆ©sine) rencontre de deux
    microtubules polaires de polaritƩ opposƩe
  • des moteurs (dynĆ©ine) associĆ©s Ć  lenveloppe
    nuclƩaire via les microtubules astraux

32
Fig 18-14
  • Prophase sĆ©paration des pĆ“les du fuseau grĆ¢ce Ć 
  • des moteurs (kinĆ©sine) rencontre de deux
    microtubules polaires de polaritƩ opposƩe
  • des moteurs (dynĆ©ine) associĆ©s Ć  lenveloppe
    nuclƩaire via les microtubules astraux

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RĆ©gulation de la longueur du fuseau les moteurs
du fuseau
  • VertĆ©brĆ©s 7 familles de moteur apparentĆ©s Ć  la
    kinƩsine
  • S. cerevisiae 5 familles de moteur
  • Augmentation du moteur ? fuseau anormalement
    long
  • Augmentation du moteur - ? fuseau anormalement
    court

34
Fig 18-15
  • L'influence de moteurs Ć  sens de marche opposĆ©
    sur la longueur du fuseau mitotique
  • Kar 3p moteur vers -
  • Cin 8p moteur vers

Normal ?moteur - ? fuseau court ? moteur
? fuseau long
Chez la levure il ny a pas de rupture de
lenveloppe nuclƩaire pendant la
mitose Fuseau PĆ“les du fuseau
35
Chez lhomme
  • Probablement comme chez la levure
  • La phosphorylation dau moins un moteur par M-Cdk
    est nƩcessaire pour la fixation du moteur au
    fuseau

36
B PromƩtaphase
  • Rupture soudaine de lenveloppe nuclĆ©aire
  • DĆ©clenchĆ©e par la phosphorylation directe des
    lamines nuclƩaires par M-Cdk
  • Les microtubules accĆØdent aux chromosomes pour la
    1ĆØre fois

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ConsƩquences
  • PhĆ©nomĆØne de Ā recherche et captureĀ  des
    chromosomes par les microtubules
  • Un microtubule qui rencontre un chromosome
    sattache et se stabilise ? plus (zƩro) de
    catastrophes
  • Peut rencontrer un kinĆ©tochore
  • Sattache par lextrĆ©mitĆ© (bout du microtubule)
  • Le microtubule sappelle alors Ā microtubule du
    kinĆ©tochoreĀ 

38
Fig 18-16
  • Les microtubules du kinĆ©tochore

1 Ơ 40 microtubules par kinƩtochore
ADN les 2 kinƩtochores
39
(No Transcript)
40
Les kinƩtochores
41
Fig 18-19
  • Microscopie Ć©lectronique d'un kinĆ©tochore

Structure trilamellaire
42
KinƩtochore
  • RĆ“le capital dans le mouvement des chromosomes
    sur le fuseau
  • Contiennent des moteurs et des moteurs
  • Mode dattachement des microtubules aux
    kinƩtochores inconnu (dautant plus que ce bout
    se polymƩrise et se dƩpolymƩrise constamment)

43
KinƩtochore
44
Microtubule Capture A Concerted Effort Chitra
Kotwaliwale and Sue Biggins Cell, Volume 127,
Issue 6 , 15 December 2006, Pages 1105-1108
  • Attachement du kinĆ©tochore aux microtubules et sa
    rƩgulation par Aurora B
  • Le kinĆ©tochore structure protĆ©ique qui se forme
    au contact de lADN centromƩrique-est composƩ de
    multiples protƩines de liaison de faible affinitƩ
    au microtubule. Alors que le complexe Ncd80 se
    lie Ơ la charpente en rƩseau du microtubule,
    dautres composants peuvent se lier Ơ lextrƩmitƩ
    plus du microtubule.
  • En rĆ©ponse Ć  des forces de tension, Aurora B
    phosphoryle les protƩines de liaison au
    microtubule pour diminuer laffinitƩ de ces
    facteurs aux microtubules. Ceci conduit au
    dƩtachement des microtubules des kinƩtochores.
    Des facteurs comme INCENP-survivine peuvent
    exercer de nombreuses fonctions au niveau du
    kinƩtochore. En plus de leur rƓle de senseurs de
    tension rƩgulƩs par Aurora B, ces molƩcules
    peuvent aussi promouvoir une activitƩ de liaison
    au noyau du microtubule

45
KinƩtochore
  • The kinetochore is a specialized chromosomal
    structure that facilitates chromosome attachment
    and movement along spindle microtubules during
    chromosome segregation. Furthermore, the
    kinetochore communicates the actual state of its
    interaction with the spindle to a cell cycle
    regulating machinery. It is the first member of a
    signaling cascade that inhibits sister chromatid
    separation (the beginning of anaphase) if
    chromosomes lack a stable bi-polar spindle
    attachment. A defect in this checkpoint function
    has been correlated to human cancers. My group
    analyses the protein composition and structure of
    the S. cerevisiae kinetochore by mass
    spectroscopy and the function of individual
    kinetochore proteins applying cell and molecular
    biological methods.

46
KinƩtochore
  • Hierachical Structure of the Yeast Kinetochore
  • A small CEN DNA interacts with CBF3, an inner
    kinetochore complex that recruits a specialized
    nucleosome. Together these complexes recruit
    multiple discrete protein complexes, ultimately
    resulting in a large structure that mediates the
    attachment and movement of chromosomes on the
    mitotic spindle.

47
Attachement des microtubules aux kinƩtochores
  • Facile Ć  observer dans les cellules de poumon de
    tĆŖtard
  • Liaison par le cĆ“tĆ© du microtubule
  • Puis glissement rapide vers le centrosome
  • Puis lattachement latĆ©ral est converti en
    fixation par lextrƩmitƩ
  • En mĆŖme temps attachement de lautre kinĆ©tochore
    par les microtubules du centrosome opposƩ ?
  • Attachement bipolaire du chromosome

48
Fig 18-17
  • Capture des microtubules par les kinĆ©tochores

49
Constitution de la plaque mƩtaphasique
  • Les chromosomes sont tirĆ©s davant en arriĆØre ?
  • Position Ć©quidistante des pĆ“les ?
  • Plaque mĆ©taphasique

50
Fig 18-18
  • Plaque mĆ©taphasique chromosomes
  • KinĆ©tochores
  • Microtubules

51
Plaque mƩtaphasique
  • Oscillation des chromosomes
  • en attendant le signal de la sĆ©paration
  • qui est le dernier signal nĆ©gatif Ć©mis par le
    dernier kinƩtochore

52
C - MĆ©taphase
53
PAUSE
54
Fig 18-20
  • Dynamique des microtubules du fuseau mĆ©taphasique
  • rhodamine - tubuline en rouge
  • colorant bleu pour l'ADN
  • FluorescĆ©ine (caged) - tubuline en vert

1,5 mn
FluorescĆ©ine invisible parce que Ā cagĆ©eĀ 
2,5 mn
Ā dĆ©cageageĀ  de la fluorescĆ©ine par UV juste Ć 
gauche de la plaque mƩtaphasique
55
Fig 18-21
  • Microscopie Ć  fluorescence de microtubules isolĆ©s

56
Fig 18-22
  • Alignement des chromosomes sur la plaque
    mƩtaphasique par des forces opposƩes

57
Fig 18-23
  • Assemblage du fuseau sans centrosome dans un
    embryon parthƩnogƩnƩtique d'insecte Sciara
    (absence d'aster)

58
D - Anaphase
  • Anaphase A
  • Anaphase B

59
Fig 18-24(A)
  • Assemblage d'un fuseau bipolaire sans centrosome
    ni kinƩtochore
  • Billes recouvertes d'ADN bactĆ©rien en prĆ©sence
    d'extrait d'oeuf de Xenopus

60
Fig 18-24(B)
  • Assemblage d'un fuseau bipolaire sans centrosome
    ni kinƩtochore
  • Billes recouvertes d'ADN bactĆ©rien en prĆ©sence
    d'extrait d'oeuf de Xenopus

61
Fig 18-25
  • SĆ©paration des chromatides en anaphase
  • Microtubules colorĆ©s par des AC anti tubuline
    marquƩs Ơ l'or

62
Fig 18-25A
  • Forces qui sĆ©parent les chromosomes en anaphase A

63
Fig 18-25B
  • Forces qui sĆ©parent les chromosomes en anaphase B

64
Fig 18-27
  • Deux modĆØles de migration du kinĆ©tochore vers le
    pƓle pendant l'anaphase A

65
Fig 18-28
  • Diminution de la zone de chevauchement des
    microtubules chevauchant de la mƩtaphase Ơ
    l'anaphase chez les diatomƩs

66
Fig 18-29
  • Fonctionnement des moteurs protĆ©iques pendant
    l'anaphase
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