Caract

1
Caractérisation structurale d un régulateur
transcriptionnel du  Quorum Sensing  chez
Brucella abortus
2
Le  Quorum Sensing  des bactéries Gram-

•  Le Quorum Sensing est un phénomène par lequel
  laccumulation dune phéromone de faible poids
  moléculaire permet à la cellule individuelle de
  percevoir quand lunité de population minimale ou
  quorum de bactéries est atteint, pour initier
  une réponse concertée de lensemble de la
  population 
• (Fuqua 1994)

Production de lumière chez la bactérie marine
Vibrio fischeri
Haute densité cellulaire
Autoinduction de la luminescence
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Quorum Sensing chez Vibrio fischeri

• Lux I
• La synthétase de phéromone

• OHHL La phéromone ou l autoinducteur

Lumière

• Lux R
• Le régulateur transcriptionnel
• activé par OHHL

OHHL
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Caractéristiques structurales des régulateurs de
la famille LuxR

• actifs sous forme dun dimère
• association à la membrane
• organisés en deux domaines structuraux

problèmes de purification
structures 3D
N
C
Liaison à la phéromone (HSL)
Liaison à l ADN via un motif Hélice-coude-hélice
(HTH)
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Brucella abortus, notre organisme d intérêt

• Coccobacille Gram-négatif
• Pathogène intracellulaire
• Provoque une zoonose qui atteint quelquefois
  l homme

Un système de  Quorum Sensing  a récemment été
identifié chez cette bactérie et le régulateur
transcriptionnel correspondant a été nommé BabR.
Cest un homologue de LuxR (25 d identité selon
l alignement donné par ALIGN).
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OBJECTIF
Caractériser structuralement le régulateur
transcriptionnel BabR de Brucella abortus à
laide doutils bioinformatiques . Les
différentes étapes suivies .Obtenir la
topologie de BabR et de ses homologues les plus
proches .Obtenir un modèle 3D du domaine
C-terminal de BabR pour pouvoir analyser plus en
détail le motif HTH. .Obtenir le plus
dinformations structurales possibles sur le
domaine N-terminal de BabR
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1
Obtention de la topologie de BabR et de ses
homologues
8
BabR Séquence complète
Recherche de séquences similaires (BLAST)
Sélection des homologues les plus similaires (
E-value lt à 0,01)
gt à 30 d identité avec BabR
gt à 30 d identité avec BabR LuxR
(prot.réf.)
Toutes les séquences
Alignement multiple (Match-Box,ClustalW)
Alignement multiple (Match-Box,ClustalW)
Alignement multiple (Match-Box,ClustalW)
pourcentage d identité déterminé par ALIGN
9
gt à 30 d identité avec BabR LuxR
(prot.réf.)
Méthodes de prédictions de structures secondaires
pour déterminer la topologie de BabR et des
différents homologues ( PHD, PSIpred, PREDATOR,
JPRED,PROF)
CONSENSUS des méthodes de prédictions de
structures secondaires
10
Méthode utilisée pour réaliser le consensus
Score PHD
Score PSIPRED
11
Consensus des différentes méthodes pour les 11
séquences (BabR et ses homologues ( en moyenne
240 a.a.))
N
BabR
HOMOL.
LuxR
Dom. N-term
Dom. C-term
C
HELICE a
BRIN b
12
2
Obtention du modèle 3D du domaine C-terminal de
BabR et analyse plus détaillée du HTH
13
Domaine C-Terminal de BabR
Recherche d homologues dans la banque de
structures PDB 1 résultat significatif NarL
(E-value0,077)
Reconnaissance de  Fold  (3DPSSM, THREADER 2.5,
TOPITS, GENTHREADER, PSI-BLAST BORK) 1 résultat
significatif (4 méthodes sur 5) NarL
14

• Détermination dun consensus des alignements
  BabR-NarL fournis par différentes méthodes
• Alignements séquence-séquence
• Alignements séquence-structure

• ALIGNEMENT SEQUENCE-STRUCTURE OPTIMAL
• 61 derniers résidus de BabR alignés de façon
  certaine avec NarL (dom. Cterm)
• Les autres résidus lien flexible et donc
  alignement incertain

15
Alignment BabR Cterm.-NarL final
16
Le modèle du domaine C-terminal de BabR
17
Caractérisation plus détaillée du HTH 1. Analyse
de 4 complexes ADN-protéine
-répresseur ? -répresseur LexA
-répresseur P22 -répresseur Cro
Visualisation des ponts H entre le HTH et les
bases nucléotidiques de chaque complexe
Détermination des résidus de chaque HTH
interagissant de manière spécifique avec l ADN
18
COMPLEXE HTH-ADN (1QAA)
19
Détermination des résidus interagissant de
manière spécifique avec l ADN
20
2. Extrapolation au domaine HTH de BabR
(d après l analyse HTH-ADN et l alignement
avec LuxR)
21
3
Caractérisation structurale du domaine N-terminal
de BabR
22
Domaine N-Terminal de BabR
Recherche de séquences similaires (BLAST) Aucun
résultat significatif
Reconnaissance de  Fold  (3DPSSM, THREADER 2.5,
TOPITS, GENTHREADER, PSI-BLAST BORK) Pas de
structure mais 1 topologie donnée par plusieurs
méthodes Le  Rossman Fold 
23
Modèle topologique d une protéine de type
 Rossman fold 
24
Structure 3D d une protéine adoptant une
topologie de  Rossman fold 
25
Modèle topologique du domaine N-term. de BabR
L alignement BabR-LuxR permet de définir sur la
topologie les résidus importants dans la liaison
à l HSL et donc de localiser la région de
liaison.
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CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

• But dun modèle générer des hypothèses
  testables au laboratoire
• Nous avons généré des hypothèses pour le domaine
  N-terminal et pour le domaine C-terminal. Nous
  avons pu caractériser structuralement une
  protéine de la famille LuxR.
• Des résidus ont été prédits comme importants,
  soit dans la liaison à l ADN soit à la
  phéromone ils pourront donc être testés par des
  expériences de mutagenèse dirigée.