Cintique et stochiomtrie

1
Cinétique et stochiométrie

• A. Garnier
• GCH-21399
• A-2006

2
Cinétique et stochiométrie

• Définition
• Les termes de base
• Les modes dopération
• Les relations de base
• Détermination théorique
• Détermination expérimentale
• Taux initiaux
• Cuvée
• Chemostat
• Stop flow

3
Croissance cellulaire - variables
4
Mode dopération

• Système fermé cuvée (batch)

• Aucune entrée ou sortie
• Régime transitoire
• dX/dt rX, dS/dt rS
• À t 0, X X0, S S0

5
Cuvée alimentée (Fed-batch)
F(t), Sin

• Alimentation seulement
• Régime transitoire
• À t 0, V V0, X X0, S S0
• F sera contrôlé de manière à maintenir S
  constant, SS0Sc
• Si S est constant, m le sera aussi, m mc

V, X, S
6
Chemostat (continu, CSTR)
F, Sin

• Une entrée, une sortie
• Mélange idéal Xout X, Sout S, Pout P
• Après une période initiale dadaptation, ce
  système atteindra un régime permanent
• V cst, X cst, S cst, P cst

F, S, X, P
V, X, S, P
7
Chemostat avec recirculation

• Permet de concentrer les cellules dans le
  bioréacteur
• Permet de repousser le lavage
• Développement pour X seulement

F F(1w)
F(1w)
Fc, Xc
Fex, Xx
V, X
wF, Xx
Bioréacteur Décanteur
8
Croissance cellulaire type de modèles
Structuré Tient compte de métabolites
intra-cellulaires Ségrégé Tient compte dune
distribution de population
9
Modèles de croissance

• Du plus simple au plus compliqué
• Exponentiel (ordre 0!!)
• Linéaire (logistique)
• Monod
• Autres
• Phénomènes connexes
• Maintenance
• Mortalité
• Production
• Luedeking-Piret combiné aux différents modèles

10
Modèle enzymatique - Monod

• Pour un système fermé (cuvée) en supposant YX/S
  constant

(1)
(2)
(3)

• Une variable indépendante, 3 variables
  dépendantes,
• trois équations Une solution!

11
Modèle de Monod

• Équation 3 nest peut-être pas nécessaire

Xmax-X Yx/s S
Alors
12
Modèle de Monod
13
Modèle de Monod
Sachant que
14
Modèle de Monod
S (Xmax-X)/Yx/s
15
Détermination théorique

• Cinétique
• Rendement modèles structurés (stochiométriques
  et autres)

16
Une vue très simplifiée du métabolisme cellulaire
Le catabolisme génère de lATP et du NADH
Modèle stochiométrique (cliquez ici)
17
Autres valeurs du coefficient de rendement
(BaileyOllis, McGraw-Hill, 1986)
18
Détermination expérimentale

• Coefficient de rendement
• Cinétique
• Taux initiaux
• Stop-flow
• Cuvée
• Chemostat

19
Détermination expérimentale du coefficient de
rendement - YX/S constant
S (Xmax-X)/Yx/s
20
Estimation des rendements en cuvée
Avec des données de t, X, S, on peut calculer,
Yx/s par un graphe de X vs S
Ici, Yx/s 0,5
21
Effet de maintenance

• ?S ?S(croissance) ?S(maintenance)
• rS 1/YG rX m X
• qs 1/YG m m
• 1/Yx/s qs/m 1/YG m/ m

22
Effet de maintenance

• 1/Yx/s qs/m 1/YG m/ m

23
Effet de mortalité

• Le taux de mortalité cellulaire rd - kdX
  où kdcste
• Donc en cuvée dX/dt mX kdX (m kd)X

En général, on néglige la maintenance et la
mortalité en cuvée
24
Mécanisme de débordement effet sur la cinétique
et le rendement
glutamine
25
Détermination de la cinétique Taux initiaux
Évaluation de qglc, qgln, qlact et qNH3
26
(No Transcript)
27
(No Transcript)
28
Systèmes danalyse de cinétique rapide
Méthode de flux arrêté (Stopped-flow)

Un moteur va actionner 2 ou 3 seringues contenant
les réactifs qui seront mélangés.
Le mélange est ensuite aspiré dans la cuvette
dobservation par la seringue  stop .
29
Systèmes danalyse de cinétique rapide
Moteur
Réactif 1
Réactif 2
Temps mort Temps pour lequel on ne peut avoir
de données (temps de mélange)
Mélangeur
De lordre de 1 milliseconde.
Moteur
Moteur
30
Systèmes danalyse de cinétique rapide
Les composés seront analysés par des méthodes
spectrophotométriques à laide de

• Photodiodes
• Dichroïsme circulaire
• Tube photomultiplicateur
• Matrice CCD (2048 longueurs dondes
  analysées en 3,5 millisecondes)

31
Systèmes danalyse de cinétique rapide
Méthode de flux étanché (Quenched-flow)

Méthode utilisées lorsquon ne dispose pas de
méthodes optiques satisfaisantes pour étudier
lapparition des produits et des intermédiaires.
Il faut arrêter rapidement les réactions
enzymatiques pour pouvoir collecter les mélanges
et les analyser.
32
Systèmes danalyse de cinétique rapide
Méthode de flux étanché (Quenched-flow)

• Types détanchage
• Étanchage chimique Ajout dacide ou de base
  (ex. HCl 1M)
• Étanchage physique Congélation ultra-rapide.

33
Systèmes danalyse de cinétique rapide
Moteur
Moteur
Délai réactionnel de lordre de 2 à 100
millisecondes
Réactif 1
Réactif 2
Mélangeur
Agent étanchant
Mélangeur
Chambre réactionnelle linéaire
Récupération des fractions
34
Systèmes danalyse de cinétique rapide
Les fractions recueillies sont analysées par des
méthodes non-optiques

• Spectroscopie de masse  en ligne 
• Chromatographie HPLC ou en phase gazeuse
• Électrophorèse sur gel,
• Comptage à scintillation,
• etc

35
Estimation des paramètres de Monod en cuvée

• Puis on peut reformuler léquation de X pour
  isoler des termes reliés linéairement

t
t
Y b m X
36
Monod estimation des paramètres
mmax 1
m 0,2475 KsYx/s/Xmax Ks
0,247510,1/0,5 Ks 5
37
Utilisation du Chemostat pour la détermination
des paramètres cinétiques

• Relation cinétique, par exemple Monod

38
Prochain labo Cuvée alimentée (Fed-batch)
F(t), Sin

• Alimentation seulement
• Régime transitoire
• À t 0, V V0, X X0, S S0
• F sera contrôlé de manière à maintenir S
  constant, SS0Sc
• Si S est constant, m le sera aussi, m mc

V, X, S
39
Cuvée alimentée (Fed-batch)

• 3 bilans seront nécessaires pour obtenir un
  modèle de ce système

F
.
40
Cuvée alimentée (Fed-batch)
41
Cuvée alimentée (Fed-batch)
F
0
42
Cuvée alimentée (Fed-batch)