Prsentation PowerPoint

1
3L5BMBM
Biochimie Structurale I
2
Evaluation 3L5BMBM 2005-2006 Note de T.P.
moyenne écrits début T.P. et comptes-rendus fin
T.P. coef 1 oral  publication
protéome  coef 1 examen écrit février
T.P. coef 2 note /20 Note
cours écrit en janvier note
/20 oral en janvier optionnel si note écrit gt
10/20 (si pas doral on reporte la note
décrit) optionnel si note écrit lt
10/20 note
/20 Session JANVIER Note finale et mentions
écrit cours (coef 2) oral cours (coef 1)
T.P. (coef 1) En cas de note finale lt à 10/20 ?
échec, session SEPTEMBRE. Note finale et
mentions écrit (coef 2) oral (coef 1) T.P.
(coef 1, note janvier)
3
ACIDES AMINES - PROTEINES
INTRODUCTION
Les protéines sont une classe de molécules
biologiques  de première importance  (du grec
proteios).
Les protéines sont des macromolécules de type
polymère.
Dans une cellule procaryote, le nombre de
protéines différentes varie entre 1500 et 2000.
Dans les cellules eucaryotes, cette quantité
passe à 12-15000.
Chacune des protéines présentes dans les cellules
a une structure qui est déterminée génétiquement
et de ce fait, possède une taille prédéfinie
(altérée parfois après traduction).
Elles ont des rôles très variés au sein dune
cellule et au sein dun organisme.
4
ACIDES AMINES - PROTEINES
INTRODUCTION
Au sein dune cellule, chaque protéine présente
joue un rôle particulier et est souvent
indispensable pour un fonctionnement correct de
lensemble.
Le nombre de copies dune protéine donnée dans
une cellule est également critique. (exemple du
transporteur de glucose GLUT2 dans une cellule
hépatique quantité normale 150 000, en dessous
de 20 000 ? diabète)
Les protéines sont synthétisées et dégradées en
permanence dans les cellules.
5
ACIDES AMINES - PROTEINES
INTRODUCTION
Elles jouent le rôle de transporteurs
- canaux ioniques - transporteurs de sucres,
acides aminés - transporteurs de lipides entre
organes (albumine,
apolipoprotéines) - transport inverse,
élimination des toxiques
(Multi-Drug Resistance Protein)

• Elles interviennent dans limmunité
• - anticorps (immunoglobulines)
• - protéines du système du complément
• - protéines de la cicatrisation (fibrine)
• - protéines du CMH (Complexe Majeur
  dHistocompatibilité)

• Elles ont des rôles structuraux
• - cytosquelette (tubuline, actine).
• - contraction musculaire (myosine)
• - forme des vacuoles (clathrine)
• - organisation de lADN (histones)

6
ACIDES AMINES - PROTEINES
INTRODUCTION
Microtubules cellule endothéliale dartère
pulmonaire bovine
Filaments d'actine cellule endothéliale dartère
pulmonaire bovine
7
ACIDES AMINES - PROTEINES
INTRODUCTION
On voit très nettement le contour des cellules.
Les noyaux sont visibles.
8
ACIDES AMINES - PROTEINES
INTRODUCTION
compartimentation
9
ACIDES AMINES - PROTEINES
INTRODUCTION

• Elles participent à la communication entre les
  différents organes dun animal
• - hormones
• (insuline, EPO, leptine, enképhalines)
• - récepteurs aux hormones et autres médiateurs
  (acétylcholine, sérotonine, adrénaline)

• Elles ont un rôle dans la génétique cellulaire
• - facteurs de transcription (HIF-1, p53, Sp1)
• - répresseurs géniques

• Elles interviennent dans le métabolisme en
  laccélérant
• - enzymes
• (exclusivement des protéines ou presque... )

10
ACIDES AMINES - PROTEINES
INTRODUCTION
PEPTIDES ET PROTEINES UNE DIFFERENCE DE TAILLE
Tous deux sont des polymères dacides aminés.
Un peptide est le plus souvent une petite
protéine qui peut dialyser, avec une limite
imprécise dans la dimension. Autrefois, on la
fixait à 10000 Da (soit 80-100 acides aminés).
Aujourdhui, on considère linsuline comme la
plus petite des protéines (5734 Da).
oligopeptides lt polypeptides lt protéines
11
ACIDES AMINES - PROTEINES
INTRODUCTION
STRUCTURES PRIMAIRE, SECONDAIRE, TERTIAIRE ET
QUATERNAIRE
La structure primaire est la structure chimique
(covalente) quels acides aminés et dans quel
ordre.
La structure secondaire correspond aux structures
spatiales régulières (hélices a, plis b,
feuillets b etc).
La structure tertiaire concerne larrangement
dans lespace de ces structures secondaires cest
à dire la position dans lespace de chaque atome.
La structure quaternaire est une association de
structures tertiaires certaines protéines
existent sous forme de complexes comportant alors
plusieurs sous-unités (exemple ATPase-synthétase
a3b3dge).
12
ACIDES AMINES - PROTEINES

A- STRUCTURES ET REACTIVITE

I- Structures et propriétés physiques

1- Structures des acides aminés
2- Acido-basicité
3- Hydrophobicité
4- Propriétés spectrales
II- Propriétés chimiques
1- Liaison peptidique
2- Fonction amine
3- Fonction a-aminoacide
4- Réactivité des chaînes latérales
B- SEQUENCAGE DE PROTEINES
I- Stratégie générale
II- Fragmentation
1- Analyse dacides aminés
2- Coupures chimiques CNBr, NBS, H
3- Coupures enzymatiques
III- Microséquençage
1- Dégradation dEdman
2- Détermination du N-terminal
3- Détermination du C-terminal
4- Spectrométrie de masse
13
Le carbone qui porte la fonction acide
carboxylique et la fonction amine est appelé a.
Cette forme de lacide aminé nest retrouvée
quen très faible proportion (0,001 au mieux).
14
ACIDES AMINES - PROTEINES
A pH faible cette forme protonée de lacide aminé
est prépondérante.
15
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-R
O
N
a
R
C
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
16
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Formes L et D
H N C C O H
H-
-H
acide aminé série L (S)
H-
-R
O
a
Ces 2 molécules sont identiques au niveau
propriétés chimiques. Seuls les acides aminés de
la série L sont retrouvés dans les protéines.
Le carbone a est sauf exception chiral et il
existe donc des énantiomères L et D.
17
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Formes L et D
H N C C O H
H-
-H
acide aminé série D (R)
R-
-H
O
a
Ces 2 molécules sont identiques au niveau
propriétés chimiques. Seuls les acides aminés de
la série L sont retrouvés dans les protéines.
Le carbone a est sauf exception chiral et il
existe donc des énantiomères L et D.
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Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-H
O
glycine (G)
a
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
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Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH3
O
alanine (A)
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
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Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH-CH3
O
CH3
valine (V)
acide aminé essentiel
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
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Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH2-CH-CH3
O
CH3
leucine (L)
acide aminé essentiel
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
22
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH-CH2-CH3
O
CH3
isoleucine (I)
acide aminé essentiel
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
23
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
PHE
TYR
TRP
LYS
ARG
HIS
ASP
GLU
isoleucine (I)
acide aminé essentiel
a
b
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Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
CH2
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
CH2
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH2
O
proline (P)
b
a
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
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Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH2-OH
O
sérine (S)
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
26
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH-OH
O
CH3
thréonine (T)
acide aminé essentiel
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
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Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
PHE
TYR
TRP
LYS
ARG
HIS
ASP
GLU
thréonine (T)
acide aminé essentiel
a
b
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Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH2-SH
O
cystéine (C)
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
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Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH2-CH2-S-CH3
O
méthionine (M)
acide aminé essentiel
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
30
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH2-C-NH2
O
O
asparagine (N)
acide aminé essentiel
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
31
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH2-CH2-C-NH2
O
O
glutamine (Q)
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
32
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH2-
O
phénylalanine (F)
acide aminé essentiel
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
33
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH2- -OH
O
tyrosine (Y)
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
34
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
PHE
TYR
TRP
LYS
ARG
HIS
ASP
GLU
tryptophane (W)
acide aminé essentiel
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
35
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-(CH2)4-NH3
O
lysine (K)
acide aminé essentiel
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
36
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-(CH2)3-NH-C-NH2
O
NH2
arginine (R)
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
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Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
N-H
H-
-CH2-
O
histidine (H)
H
H
N
acide aminé essentiel
H
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
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Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH2-C-OH
O
O
aspartate (D)
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
39
Acides aminés
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Lacide aminé est la brique de base des protéines
Chaîne latérale R
GLY
ALA
VAL
LEU
ILE
PRO
SER
THR
CYS
MET
ASN
GLN
H N C C O H
PHE
TYR
TRP
LYS
H-
-H
ARG
HIS
ASP
GLU
H-
-CH2-CH2-C-OH
O
O
glutamate (E)
a
b
Vingt acides aminés différents ont été identifiés
dans les protéines. Il en existe environ 400 qui
ninterviennent pas dans la structure des
protéines.
40
ACIDES AMINES - PROTEINES
On retrouve dans la nature des acides aminés aux
structures beaucoup plus variées mais qui ne sont
pas incorporés dans des protéines.
On retrouve également beaucoup dacides aminés de
la série D.
41
ACIDES AMINES - PROTEINES
Symbole Code 3 lettres Nom A
Ala Alanine C Cys
Cystéine D Asp Aspartate
E Glu Glutamate F
Phe Phénylalanine G Gly
Glycine H His Histidine I
Ile Isoleucine K
Lys Lysine L Leu
Leucine M Met Méthionine N
Asn Asparagine P
Pro Proline Q Gln
Glutamine R Arg Arginine
S Ser Sérine T
Thr Thréonine V Val
Valine W Trp Tryptophane
Y Tyr Tyrosine
42
ACIDES AMINES - PROTEINES
La masse moléculaire dun acide aminé varie entre
75 Da pour la glycine et 204 Da pour le
tryptophane.
Quand une protéine est formée de 50 acides aminés
on dit quelle est composée de 50 résidus
dacides aminés car il y a eu formation de 49
liaisons peptidiques et donc départ (comme on va
le voir) de 49 molécules deau. Il ne reste donc
que des acides aminés déshydratés des résidus.
La masse moléculaire moyenne dun résidu dacide
aminé est de 115 Daltons (Da).
Le Dalton est une unité de masse qui correspond à
peu près à la masse dun atome dhydrogène. Exprim
é en g, 1 Da correspond à environ 1,66 10-24 g.
John Dalton (1766-1844) a donné son nom à cette
unité. Il a été un de ceux qui ont développé la
théorie atomique de la matière.
Une protéine de 50 résidus aura donc une masse
moléculaire de 50 x 115 5750 Da ou 5,75 kDa. La
masse molaire de la protéine sera 5750 g/mole.
43
ACIDES AMINES - PROTEINES

A- STRUCTURES ET REACTIVITE

I- Structures et propriétés physiques

1- Structures des acides aminés

2- Acido-basicité
3- Hydrophobicité
4- Propriétés spectrales
II- Propriétés chimiques
1- Liaison peptidique
2- Fonction amine
3- Fonction a-aminoacide
4- Réactivité des chaînes latérales
B- SEQUENCAGE DE PROTEINES
I- Stratégie générale
II- Fragmentation
1- Analyse dacides aminés
2- Coupures chimiques CNBr, NBS, H
3- Coupures enzymatiques
III- Microséquençage
1- Dégradation dEdman
2- Détermination du N-terminal
3- Détermination du C-terminal
4- Spectrométrie de masse
44
ACIDES AMINES - PROTEINES
Les aminoacides en solution à pH neutre se
trouvent sous forme dions dipolaires ou
zwitterion.
Létat dionisation dun aminoacide dépend du pH
du milieu.
fonction acide
Constante déquilibre
Équation dHenderson- Hasselbalch
45
ACIDES AMINES - PROTEINES
Ceci est également valable pour la fonction
a-aminée.
Cette fonction est dite basique puisquelle ne
libère son proton que pour de faibles
concentrations de H dans le milieu.
fonction amine
Constante déquilibre
Équation dHenderson- Hasselbalch
46
ACIDES AMINES - PROTEINES
47
ACIDES AMINES - PROTEINES
Exemple alanine
Comment déterminer expérimentalement ces valeurs
de pKa ?
48
ACIDES AMINES - PROTEINES
pKa
Groupe
acide base H
acide carboxylique terminal
2-3
-COOH -COO- H
acide glutamique et aspartique
3-4,5
-COOH -COO- H
peut varier selon le microenvironnement entre 3
et 9
-CH2-
-CH2-
H
6
histidine
N
HN
NH
NH
amine terminale
8,5-9,5
-NH3 -NH2 H
7-8,5
cystéine
-SH -S- H
O-
H
10-11
OH
tyrosine
10-11
-NH3 -NH2 H
lysine
NH2
NH
H
H
12
arginine
-N-C -N-C H
NH2
NH2
49
ACIDES AMINES - PROTEINES

A- STRUCTURES ET REACTIVITE

I- Structures et propriétés physiques

1- Structures des acides aminés

2- Acido-basicité

3- Hydrophobicité
4- Propriétés spectrales
II- Propriétés chimiques
1- Liaison peptidique
2- Fonction amine
3- Fonction a-aminoacide
4- Réactivité des chaînes latérales
B- SEQUENCAGE DE PROTEINES
I- Stratégie générale
II- Fragmentation
1- Analyse dacides aminés
2- Coupures chimiques CNBr, NBS, H
3- Coupures enzymatiques
III- Microséquençage
1- Dégradation dEdman
2- Détermination du N-terminal
3- Détermination du C-terminal
4- Spectrométrie de masse
50
ACIDES AMINES - PROTEINES
Échelle dhydrophobicité selon Kyte et Doolittle
(1982) Journal of Molecular Biology 157, 105-132
51
ACIDES AMINES - PROTEINES

A- STRUCTURES ET REACTIVITE

I- Structures et propriétés physiques

1- Structures des acides aminés

2- Acido-basicité

3- Hydrophobicité

4- Propriétés spectrales
II- Propriétés chimiques
1- Liaison peptidique
2- Fonction amine
3- Fonction a-aminoacide
4- Réactivité des chaînes latérales
B- SEQUENCAGE DE PROTEINES
I- Stratégie générale
II- Fragmentation
1- Analyse dacides aminés
2- Coupures chimiques CNBr, NBS, H
3- Coupures enzymatiques
III- Microséquençage
1- Dégradation dEdman
2- Détermination du N-terminal
3- Détermination du C-terminal
4- Spectrométrie de masse
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ACIDES AMINES - PROTEINES
ABSORPTION U.V.-visible
Solutions de tryptophane, tyrosine et
phénylalanine à 1 mM
On détecte très souvent la présence de protéines
dans un milieu par mesure de la D.O. à 280 nm.
53
ACIDES AMINES - PROTEINES
Fluorescence
Il arrive que certaines molécules (souvent
aromatiques) soient capables dabsorber de
lénergie sous forme de photons lumineux et de
redonner cette énergie au milieu sous forme de
chaleur (énergie vibratoire) et de lumière.
La lumière émise a une énergie toujours
inférieure et donc une longueur donde toujours
supérieure à celle de la lumière excitatrice.
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ACIDES AMINES - PROTEINES
Fluorescence
Lémission de fluorescence est sensible à
lenvironnement local de la molécule qui
fluoresce (présence ou absence deau par exemple).
lex 280 nm
TrpEtOH TrpH2O
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ACIDES AMINES - PROTEINES
Dichroïsme circulaire
Les molécules présentant des carbones chiraux et
des structures répétitives vont absorber la
lumière polarisée dans lU.V. on pourra ainsi
déterminer les pourcentages des différentes
structures secondaires présentes dans les
protéines.
Spectroscopie infra-rouge
Les liaisons entre atomes des fonctions chimiques
vibrent si on les excitent dans linfra-rouge. On
peut ainsi enregistrer le spectre dabsorption IR
des protéines.
Les acides aminés  acides  (Asp et Glu) ont la
fonction acide carboxylique de leur chaîne
latérale qui va vibrer différemment si elle est
sous forme COO- ou COOH 1600 cm-1 et 1720 cm-1.
La liaison peptidique CO vers 1600-1700 cm-1
et N-H vers 1500-1550 cm-1.
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A- STRUCTURES ET REACTIVITE

I- Structures et propriétés physiques

1- Structures des acides aminés

2- Acido-basicité

3- Hydrophobicité

4- Propriétés spectrales

II- Propriétés chimiques

1- Liaison peptidique
2- Fonction amine
3- Fonction a-aminoacide
4- Réactivité des chaînes latérales
B- SEQUENCAGE DE PROTEINES
I- Stratégie générale
II- Fragmentation
1- Analyse dacides aminés
2- Coupures chimiques CNBr, NBS, H
3- Coupures enzymatiques
III- Microséquençage
1- Dégradation dEdman
2- Détermination du N-terminal
3- Détermination du C-terminal
4- Spectrométrie de masse
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ACIDES AMINES - PROTEINES
Rappels de chimie
Les acides aminés sont des molécules
bifonctionnelles
58
Acides aminés
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Liaison peptidique
alanine
a
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Acides aminés
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Liaison peptidique
alanine
a
60
Acides aminés
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Liaison peptidique
alanine
a
liaison peptidique (fonction amide)
61
Acides aminés
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Liaison peptidique
alanine
a
liaison peptidique (fonction amide)
62
Acides aminés
Acides aminés
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
carbone
oxygène
hydrogène
azote
soufre
Liaison peptidique
alanine
a
liaison peptidique (fonction amide)
Ala-Ala-Ala
liaison peptidique (fonction amide)
La liaison peptidique est très stable (gt
ester). Lhydrolyse nécessite des conditions
drastiques HCl 6N, 110C, 24h.
63
ACIDES AMINES - PROTEINES
Quelques exemples de peptides dintérêt
Enképhalines
Neuropeptides endogènes découverts par Hughes et
Kosterlitz en 1975 (également produits dans les
cellules cardiaques).
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met
Ils agissent sur les mêmes récepteurs que les
opiacés (morphine et dérivés).
b endorphine
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pr
o-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Val-Lys-Asn-
Ala-His-Lys-Lys-Gly-Gln
Elle se lie aux récepteurs aux opioïdes µ et d.
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ACIDES AMINES - PROTEINES
Quelques exemples de peptides dintérêt
Vasopressine
Hormone peptidique post-hypophysaire
Agit sur le rein en provoquant la rétention deau
(vasoconstricteur).
Ocytocine
Agit sur la contraction des muscles lisses en
particulier lutérus lors de laccouchement.
Sanofi-Aventis et Novartis en vendent plusieurs
kilos/an.
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ACIDES AMINES - PROTEINES
Quelques exemples de peptides dintérêt
Thyrotropin Releasing Factor
pyrGlu-His-Pro-NH2
Peptide produit par les cellules de
lhypothalamus qui stimule la production de
thyréostimuline par lhypophyse.
La société Merck en produit 100 g/an (efficacité
à dose de lordre du µg).
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ACIDES AMINES - PROTEINES
Quelques exemples de peptides dintérêt
Alaméthicine
Ac-Aib-Pro-Aib-Ala-Aib-Ala-Gln-Aib-Val-Aib-Gly-Leu
-Aib-Pro-Val-Aib-Aib-Glu-Gln-Phol
Antibiotique de Trichoderma viridis. Cest un
ionophore la molécule fait des pores dans les
membranes lipidiques.
a amino isobutyrate
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ACIDES AMINES - PROTEINES
Quelques exemples de peptides dintérêt
Aspartame édulcorant alimentaire
phénylalanine
acide aspartique
méthanol
La société Searle (rachetée par Monsanto) en
produit 4000 tonnes/an.
68
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A- STRUCTURES ET REACTIVITE

I- Structures et propriétés physiques

1- Structures des acides aminés

2- Acido-basicité

3- Hydrophobicité

4- Propriétés spectrales

II- Propriétés chimiques

1- Liaison peptidique

2- Fonction amine
3- Fonction a-aminoacide
4- Réactivité des chaînes latérales
B- SEQUENCAGE DE PROTEINES
I- Stratégie générale
II- Fragmentation
1- Analyse dacides aminés
2- Coupures chimiques CNBr, NBS, H
3- Coupures enzymatiques
III- Microséquençage
1- Dégradation dEdman
2- Détermination du N-terminal
3- Détermination du C-terminal
4- Spectrométrie de masse
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ACIDES AMINES - PROTEINES
La synthèse peptidique à grande échelle comme
pour laspartame, se fait actuellement selon le
principe de Merrifield synthèse en phase solide.
La synthèse des peptides se fait à la surface de
billes de polymères. On greffe le premier acide
aminé dun peptide (acide aminé N-terminal) en
dernier.
70
ACIDES AMINES - PROTEINES

• Dérivés tertiobutoxycarbonyl tBoc-aminoacides

chlorure de t-butyloxycarbonyle
La déprotection peut seffectuer par acidolyse
avec HF et CF3COOH.
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ACIDES AMINES - PROTEINES

• Dérivés benzoxycarbonyl Cbz-aminoacides

La déprotection peut seffectuer par acidolyse ou
par hydrogénation catalytique (Pd).
72
ACIDES AMINES - PROTEINES

• Dérivés fluorénylméthylène-oxycarbonyl
  Fmoc-aminoacides

La déprotection seffectue à laide dune base.
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ACIDES AMINES - PROTEINES
Dérivatisation réversible
Anhydride phtalique
La déprotection seffectue avec lhydrazine
NH2-NH2
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ACIDES AMINES - PROTEINES
Dérivatisation réversible
Déprotection

• Dérivés tertiobutoxycarbonyl tBoc-aminoacides

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ACIDES AMINES - PROTEINES
Dérivatisation réversible
Déprotection

• Dérivés fluorénylméthylèneoxycarbonyl
  Fmoc-aminoacides

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ACIDES AMINES - PROTEINES
I- Préparation des acides aminés avec fonction
amine protégée
II- Ancrage sur résine inerte de polystyrène
réticulé
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ACIDES AMINES - PROTEINES
III- Déprotection de la fonction amine
IV- Activation des Boc-aminoacides
78
ACIDES AMINES - PROTEINES
V- Formation de liaison peptidique
79
ACIDES AMINES - PROTEINES
VI- Libération du peptide final
Les rendements de chaque étape sont de 99,5 ce
qui permet dobtenir des quantités importantes de
peptide de très haute pureté (peu de réactions
secondaires). Début des années 90, la protéase
(99 acides aminés) du VIH (virus du SIDA) a été
produite par cette méthode.
80
ACIDES AMINES - PROTEINES
ABI Pioneer two column peptide synthesis
machine.
Les automates permettent de synthétiser assez
rapidement des quantités appréciables de peptides
(0,1 mmole en routine) soit autour de 200 mg de
peptide pour 20 résidus.
81
ACIDES AMINES - PROTEINES
Protection des chaînes latérales des acides aminés
82
ACIDES AMINES - PROTEINES
Dérivatisation irréversible

• méthode de Sanger DNFB ou 2,4
  dinitrofluorobenzène

Le DNP-aa est un dérivé de couleur jaune, non
hydrolysable en milieu acide, le NaHCO3 permet de
neutraliser lacidité due au HF formé.
83
ACIDES AMINES - PROTEINES
Dérivatisation irréversible

• chlorure de dansyl (chlorure de
  diméthylaminonaphtalène sulfonyle)

Le DNS-aa est un dérivé de couleur jaune clair,
non hydrolysable en milieu acide. Le DNS-aa est
fluorescent sous U.V. détection sur plaque CCM.
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ACIDES AMINES - PROTEINES
Dérivatisation irréversible

• ortho-phtalaldéhyde

Proline et hydroxyproline ne réagissent pas
(amines secondaires). On sépare les OPA-aa sur
colonne RP-HPLC sensibilité 1 à 10 pmoles daa.
85
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES
Dérivatisation irréversible de la eNH3 de lysine

• méthylacétimidate

H
La réaction est spécifique des lysines haut
rendement de marquage.

• isothiocyanates

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ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES
Dérivatisation irréversible de la eNH3 de lysine

• isocyanates

• agents acylants

anhydride succinique
R-NH3
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A- STRUCTURES ET REACTIVITE

I- Structures et propriétés physiques

1- Structures des acides aminés

2- Acido-basicité

3- Hydrophobicité

4- Propriétés spectrales

II- Propriétés chimiques

1- Liaison peptidique

2- Fonction amine

3- Fonction a-aminoacide
4- Réactivité des chaînes latérales
B- SEQUENCAGE DE PROTEINES
I- Stratégie générale
II- Fragmentation
1- Analyse dacides aminés
2- Coupures chimiques CNBr, NBS, H
3- Coupures enzymatiques
III- Microséquençage
1- Dégradation dEdman
2- Détermination du N-terminal
3- Détermination du C-terminal
4- Spectrométrie de masse
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ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• PITC Formation de PTH-aa

PITC phénylisothiocyanate
phénylthiohydantoïne-aa
PTH-aa
Le réactif est utilisé pour lanalyse des acides
aminés.
89
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• Réaction à la ninhydrine

Bien que le produit soit toujours le même, il y a
des nuances dans la couleur (du violet au
marron). La proline sort jaune.
90
ACIDES AMINES - PROTEINES

A- STRUCTURES ET REACTIVITE

I- Structures et propriétés physiques

1- Structures des acides aminés

2- Acido-basicité

3- Hydrophobicité

4- Propriétés spectrales

II- Propriétés chimiques

1- Liaison peptidique

2- Fonction amine

3- Fonction a-aminoacide

4- Réactivité des chaînes latérales
B- SEQUENCAGE DE PROTEINES
I- Stratégie générale
II- Fragmentation
1- Analyse dacides aminés
2- Coupures chimiques CNBr, NBS, H
3- Coupures enzymatiques
III- Microséquençage
1- Dégradation dEdman
2- Détermination du N-terminal
3- Détermination du C-terminal
4- Spectrométrie de masse
91
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• Les acides aminés hydroxylés Ser Thr Tyr

- Coupure avec du periodate NaIO4 (les acides
aminés doivent être N-terminaux)
92
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• Les acides aminés hydroxylés Ser Thr Tyr

- Réaction de la tyrosine avec le
tétranitrométhane
lmax 428 nm
93
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• Les acides aminés hydroxylés Ser Thr Tyr

- Réaction de ioduration de la tyrosine
I-Cl
Introduction de radioactivité
application scintigraphie thyroïdienne
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ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• cystéine et cystine (pont disulfure)

- la cystéine possède une fonction thiol (SH) qui
soxyde facilement (très bon nucléophile)
cystine
cystéine
Les liaisons S-S entre deux cystéines permettent
de cycliser des protéines.
UN EXEMPLE LINSULINE
95
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• cystéine et cystine (pont disulfure)

Les 2 chaînes polypeptidiques sont reliées entre
elles par liaison S-S.
Il y a 6 cystéines et 3 ponts S-S 15
possibilités de conformation dont une seule
correspond à la protéine fonctionnelle.
Linsuline nest codée que par un seul gène.
Comment expliquer quil y ait 2 chaînes
peptidiques ?
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ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• cystéine et cystine (pont disulfure)

Un coiffeur est un biochimiste qui signore

• lacide thioglycolique est un agent réducteur
  utilisé pour les  permanentes  (ouverture des
  ponts disulfure de la-kératine qui devient la
  b-kératine).

• les cheveux mouillés et amollis sont frisés
  (bigoudis).

• un sel oxydant (persulfate ou perborate)
  stabilise une nouvelle structure a par formation
  de nouveaux ponts disulfure.

97
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• cystéine et cystine (pont disulfure)

Action dagent réducteur
le dithiothréitol ou DTT ou réactif de Cleland
(1965)
E0 SS/SH -0,220 V pour la cystéine à pH 7,0 et
à 25C
E0 SS/SH -0,330 V pour le DTT à pH 7,0 et à
25C
Le DTT est un thiol intéressant car
- peu volatil donc odeur plus supportable
- déplace léquilibre complètement (par rapport
au bmercaptoéthanol)
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ACIDES AMINES - PROTEINES
tricarboxyéthylphosphine réduite
tricarboxyéthylphosphine oxydée
Le TCEP est un réducteur intéressant car
- sans odeur du fait de labsence de soufre
- efficace même à pH faible
- Permet dutiliser des agents alkylant des
groupements -SH
99
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• cystéine et cystine (pont disulfure)

Oxydation des ponts disulfure H2O2 acide
performique (HCO3H)
Utile lors de lanalyse des acides aminés on
forme des SO3H car les SH ne sont pas stables en
conditions dhydrolyse acide.
100
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• cystéine et cystine (pont disulfure)

Il est facile de dériver le SH par substitution
nucléophile surtout à pH alcalin (? S- avec un
pKa ? 9)
101
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• lysine amine primaire

Une série de réactifs est utilisée pour marquer
spécifiquement les fonctions eNH2 des lysines.
102

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ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• arginine groupement guanidinium

Réaction de Sakaguchi
Phénylglyoxal (ou cyclohexanedione 1,2)
104
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• tryptophane groupement indole

Cet acide aminé est détruit par lhydrolyse acide
(HCl 6N). On préfère souvent des hydrolyses
alcalines.
Cette molécule est facilement oxydable. Afin de
limiter loxydation on utilise dans le milieu du
tosyl en présence de 3-(2-aminoéthyl)-indole qui
soxydera à la place du tryptophane.
Action du NBS N-bromosuccinimide
(oxydation contrôlée)
105
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• Asp, Glu, Asn, Gln

Lors dune hydrolyse acide, les fonctions amides
des asparagines et glutamines sont éliminées. On
retrouve une fonction acide carboxylique.
A partir dune asparagine on retrouve un
aspartate et à partir dune glutamine on retrouve
un glutamate.
Les résultats dhydrolyse sont donc donnés en
dosant Asx (Asn Asp) et Glx (Gln Glu).
Si on veut distinguer les deux, on peut par
exemple utiliser un réducteur des fonctions
acides carboxyliques le diborane (B2H6).
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ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• histidine

Lhistidine est un donneur et un accepteur de
protons.
Cest un acide aminé qui accepte aussi de façon
transitoire des groupements phosphate (chez les
procaryotes).
On peut modifier les histidines avec du
diéthylpyrocarbonate (DEPC).
En  biomol , on inhibe les RNases par du DEPC.
107
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• Pontages moléculaires cross-linking

Il est possible de relier entre eux deux acides
aminés en utilisant leur propriétés chimiques.
- activation dun carboxylate par le
dicyclohexylcarbodiimide ou DCCD
108
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• Pontages moléculaires cross-linking

Exemple lysine-cystéine
109
ACIDES AMINES - PROTEINES
ACIDES AMINES - PROTEINES

• Pontages moléculaires cross-linking

Exemple lysine-cystéine
SMCC
succinimidyl trans-4-(maléimidylméthyl)
cyclohexane-1-carboxylate