Presentacin de PowerPoint

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Técnicas de detección de anticuerpos RBA y ELISA
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RBA Radio Binding Assay o Ensayo de Unión de
Radioligando
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Sistema insulina - anti-insulina
Suero 125I-Insulina
- PEG - 2 Ac - Proteína A/G Sepharose
Calcular - BB/CT - B/F
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• Condiciones del RBA
•  
• Equilibrio de reacción
• Método de separación que no afecte el equilibrio
• El Ac debe reconocer indistintamente al Ag frío y
  al marcado
• El Ag marcado debe estar en concentraciones de
  trazas (trazador)

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• Variables que afectan la señal del RBA
•  
• AE del trazador (a A constante)
• A agregada (a AE constante)
• Ac ? K y q
• Dilución de la muestra

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Procesamiento de resultados
1.Control de unión inespecífica se incuba el Ac
con el trazador y Ag frío en exceso
Calcular B inesp. B/CT B esp. B - B
inesp.
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4.Controles positivos
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ELISA
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Sistema insulina - anti-insulina
Medida de D.O. a 495 nm
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Ö Con qué afinidad interaccionan los Acs. Con
el Ag unido a la fase sólida? Y si los Acs.
Son monovalentes? Se pueden detectar por ELISA
Acs. de baja afinidad?   Ö Qué otra variante
metodológica podría usar si un epitope de la
insulina queda siempre oculto al unirse a la
fase sólida?   Ö Cómo podría amplificar la
señal? Qué desventaja tiene?   Ö Cómo
determinaría por ELISA los isotipos de esos Acs.
específicos?
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Procesamiento de resultados
1.Control de unión inespecífica preincubación de
cada suero O.N. con insulina en concentraciones
saturantes
Qué pasaría si la insulina en exceso se agrega a
la placa en forma simultánea con el suero?
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Entonces, para cada suero
D.O. esp. D.O. suero - D.O. inesp.
Si procesamos cada muestra por duplicado
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• 4.Otros controles
• Blanco de reacción - sin coating de antígeno
• - sin muestra
• Control positivo

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ELISA de preincubación
ON
Suero Insulina-biotina
Separar B y F
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ELISA de doble paratope
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Sensibilidad y Especificidad de un Ensayo
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La confiabilidad de un resultado ( o -) depende
de la prevalencia del Ag o Ac en la población
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