BACTERIAS COLIFORMES EN AGUAS

1
NORMAS ISO PARA DETERMINACIONES MICROBIOLÓGICAS
DE AGUAS
Directiva Europea 98/83/CE Relativa a la
calidad de las aguas destinadas al consumo
humano
2
ANEXO III 1. PARÁMETROS PARA LOS QUE SE
ESPECIFICAN MÉTODOS DE ANÁLISIS
Los siguientes principios se dan ya sea como
referencia, en los casos en que se da un método
CEN/ISO, o como guía, en espera de la posible
adopción futura de nuevos métodos
internacionales CEN/ISO.
3
MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS ESPECIFICADOS

• Bacterias coliformes y Escherichia coli
• UNE-EN ISO 9308-1 2001
• Enterococos UNE-EN ISO 7899-2 2001
• Pseudomonas aeruginosa prEN ISO 12780
• Enumeración de microorganismos cultivables
• a 22ºC y 37ºC UNE-EN ISO 6222 1999
• Clostridium perfringens (incluidas las esporas)
  método
• descrito en la Directiva.

4
ISO 7899-2 ENTEROCOCOS INTESTINALES FILTRACIÓN
DE MEMBRANA

• CAMPO DE APLICACIÓN
• Aguas de bebida
• Piscinas
• Aguas desinfectadas

Grandes volúmenes de agua con bajo contenido de
enterococos
EXCEPCIONES Alto contenido en materia en
suspensión y
microorganismos interferentes
DEFINICIÓN Bacterias capaces de reducir el TTC a
36?2ºC e hidrolizar
esculina a 44?0,5ºC INTRODUCCIÓN
MEDIOS DE CULTIVO Slanetz y Bartley
Bilis Esculina agar
confirmación 100
5
(No Transcript)
6
prEN - ISO 12780 PSEUDOMONAS AERUGINOSA FILTRACIÓ
N DE MEMBRANA

• CAMPO DE APLICACIÓN
• Aguas embotelladas
• Piscinas
• Aguas de red

DEFINICIÓN Microorganismos capaces de crecer
con cetrimida a 36?2ºC y - Producen
piocianina o - Oxidasa , Fluorescentes a
360nm y amonio de acetamida
Confirmación subcultivo
MEDIOS DE CULTIVO Cetrimida-Nalidixico Kings
B Caldo acetamida
7
(No Transcript)
8
ISO 6222 RECUENTO DE MICROORGANISMOS CULTIVABLES
CAMPO DE APLICACIÓN Indicado para medir la
eficacia operativa del proceso de tratamiento del
agua de red.
DEFINICIÓN Todas las bacterias aerobias,
levaduras y hongos capaces de formar colonias en
el medio especificado bajo las condiciones
descritas
MEDIO DE CULTIVO y MÉTODO ADECUADOS? Agar
extracto de levadura Siembra en profundidad 36?
2ºC 44?4 horas 22? 2ºC 68?2 horas
9
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DEFINICIÓN
Confirmación mediante examen y, la aportación de
evidencias objetivas que demuestren el
cumplimiento de ciertos requisitos para el uso
específico previsto (ISO 17025)
10
ISO 9308-1 COLIFORMES Y ESCHERICHIA
COLI FILTRACIÓN DE MEMBRANA

• CAMPO DE APLICACIÓN Método poco selectivo
  específico
• para bacterias lesionadas.
• Aguas de bebida desinfectadas
• Aguas de bebida con bajo contenido bacteriano

DOS MÉTODOS Estándar para coliformes y E.coli
Rápido para E.coli
DEFINICIONES - Bacterias Lactosa Capaces de
crecer en medio lactosado selectivo
diferencial a 36?2ºC y producir ácido -
Coliformes Lactosa que son oxidasa - - E.coli
1.- Coliformes que producen indol del
triptófano a 44?0,5ºC 2.- Bacterias
resistentes a la bilis que producen indol
del triptófano a 44 ?0,5ºC
11
FILTRACIÓN 100 ml ó 250 ml
Lactosa TTC-Tergitol 36?2ºC, 21?3 h ó
44?4h Alternativa otra membrana 44?0,5ºC, 21?3 h
TSA Triptona-soja-agar 36?2ºC 4-5 h
Alternativa Doble capa
TBA Triptona-Bilis-Agar 440,5ºC 19-20 h
Lactosa colonias amarillas
?10 colonias
Agar no selectivo 36?2ºC, 21?2 h
Confirmación del 100 Indol
Indol de triptófano 440,5ºC , 21?3 h
Oxidasa
12
(No Transcript)
13
ISO WD 6461-2 CLOSTRIDIUM PERFRINGENS FILTRACIÓN
DE MEMBRANA
ANTECEDENTES
QUÉ MÉTODO DESARROLLAR PARA LA NUEVA NORMA?

• ESTUDIO COMPARATIVO
• Alemania 60 laboratorios
• El TSC (Triptona-Sulfito-cicloserina) recupera
  15 más que m-CP
• El m-CP resulta afectado por el tipo y lote de
  membranas
• El revelado del m-CP resulta tóxico para
  bacterias y personas
• El TSC resulta afectado por la frescura del
  medio(?1 día)
• Las pruebas de confirmación con mayores índices
  de S y E
• Nitratos
• Movilidad -
• Lactosa
• Gelatinasa

14
ISO WD 6461-2 CLOSTRIDIUM PERFRINGENS FILTRACIÓN
DE MEMBRANA

• CAMPO DE APLICACIÓN
• Todo tipo de aguas que no contengan materias
• particuladas o coloidales

DEFINICIÓN Presuntivos colonias negras a
marrón-amarillas en TSC a 441ºC
Confirmadas Presuntivas inmóviles, reducen
nitratos fermentan lactosa y licúan
gelatina
MÉTODO Pasteurización a 60 2ºC, 15 min
15
(No Transcript)
16
ANEXO III 1. PARÁMETROS PARA LOS QUE SE
ESPECIFICAN MÉTODOS DE ANÁLISIS
Los Estados miembros podrán emplear métodos
alternativos Art.7. 5 Siempre que se
demuestre que los resultados son al menos tan
fiables como los de referencia. Se facilitará a
la Comisión toda la información del método y su
equivalencia
17
ISO 17994 Criterios para el establecimiento de
la equivalencia entre métodos microbiológicos
Dos métodos son equivalentes, cuando la
diferencia relativa media de sus recuentos
confirmados no difiere significativamente de
cero y tanto el límite inferior como el superior
del intervalo de confianza al 95 de la media no
superan un nivel máximo de desviación aceptable
D (10)
18
(No Transcript)
19
EQUIVALENCIA DE MÉTODOS INTERPRETACIÓN
NO DIFERENTES
DIFERENTES
20
EQUIVALENCIA DE MÉTODOS INTERPRETACIÓN
INDIFERENTES Estadísticamente diferentes, pero
la diferencia es tan pequeña que no tiene
significación microbiológica
ó
21
EQUIVALENCIA DE MÉTODOS INTERPRETACIÓN
22
Método propio Método de referencia Muestra
1 89 112 Muestra 2 82 58 Muestra
3 123 137 Muestra 4 87 82 Muestra
5 109 103 Muestra 6 84 117 Muestra
7 65 66 Muestra 8 111 70 Muestra
9 92 93 Muestra 10 115 111
23

• Media 2,63
• Desviación estándar 23,76
• Límite inferior del IC95 -12,39
• Límite superior del IC 95 17,66
• Conclusión Resultados son no concluyentes,
• LIlt0 y LSgtD,
• Se requiere un número mayor de muestras
• nC.S2 0,1600x23,762 90 muestras

24
VALIDACIÓN - REVALIDACIÓN CONTROL DE CALIDAD
MÉTODOS CUANTITATIVOS

• INTERNO
• - Positivo Mat. Referencia en
  matriz neg. (Recuperación)
• - Negativo Mat. Referencia en
  matriz neg. (Selectividad)
• - Control de replicados tres
  (Precisión y límites de recuento)
• - Ident. de colonias diana y
  no-diana (Tasa de confirmación)
• EXTERNO
• Muestras con diferentes niveles
  (Recuperación)