RT-PCR

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Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo
real (RT- PCR) para el diagnóstico de COVID-19

• Edry Bacardi Sarmiento
• Estudiante de 5to Año de Medicina. Universidad de
  Ciencias Médicas Carlos J. Finlay. Camagüey.
  Cuba.
• email edrybacardi_at_gmail.com Teléfono
  53 55757854

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Periodos de la infección por el SARSCov-2
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Niveles de la estructura del ADN
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REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
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Función del PCR

• Amplifica las cadenas de ADN para obtener una
  concentración mayor y con ello mayor probabilidad
  de observar la fluorescencia del bromuro de
  etidio entercalado en la doble hélice al correrse
  en la electroforesis.

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Elementos que participan en el RT- PCR

• ADN polimerasa termoestable
• Nucleótidos trifosfatados (dNTP)
• Primers (de 10 a 1000 copias cocetracion final
  optima 200 µL)
• Buffer (ya sea TrisCl, TrisEDTA )
• Cloruro de magnesio (cofactor de la ADN
  polimerasa) y Cloruro de potasio
• Una capa de aceite vegetal encima de la solución
  para evitar la evaporación
• Marcador de fluorescencia (sonda de marcaje)

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Características del PCR

• La reacción completa incluye de 25 a 35 ciclos.
• La duración de la reacción completa generalmente
  es de 2 a 3 horas.
• El PCR no es eficiente amplificando fragmentos de
  ADN mayores de 150 pb.
• La temperatura de alineación optima dependerá
  de las características de los primers largo y
  contenido de pares CG de estos.

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Etapas del proceso

• Desnaturalización Se aplica calor a la mezcla de
  reactivos a 94 - 95º C por 0,5 minutos en la que
  la cadena de ADN se separa por ruptura de los
  puentes de hidrógenos. Los termocicladores se les
  coloca cada temperatura y los intervalos de
  tiempo antes de comenzar la prueba

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Etapas del proceso

• Alineación se reduce la temperatura hasta 55 ºC
  por 1,5 minuto para que los primers interactúen
  con las cadenas de ADN complementarias.
• Requisitos de cualquier primers
• Extensión de 18 a 24 nucleótidos de largo.
• Contenido de GC de alrededor de 50 es ideal.
• No debe haber complementariedad entre dos primers
• Si es posible el extremo 3 debe ser rico en CG

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• Extensión se vuelve a elevar la temperatura
  hasta 72 ºC por 1 minuto para que se una la
  polimerasa termoestable y alargue la cadena de
  ADN.

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Factores de los que depende la eficiencia de la
Reacción en cadena de la Polimerasa

• Factores exógenos
• Adecuada toma de muestra
• Cantidad de virus en el sitio de la toma de
  muestra
• Presencia de inhibidores

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Factores de los que depende la eficiencia de la
Reacción en cadena de la Polimerasa

• Factores endógenos
• Volumen total de la mezcla medio/buffer de
  recoleccion de la muestra.
• Método de preparación de la muestra
• Volumen de reactivos usados en cada paso del
  proceso de RT-PCR.
• Ensayo de RT-PCR seleccioado.

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PCR en tiempo real (RT- PCR)
Consiste en el marcaje de segmentos de ADN con
sondas de fluorescencia, que permitirán su
acumulación hasta el punto de superar el umbral
de detección de esta por parte de un software que
lo traduce en la cuantificación del producto
amplificado, a través de una curva exponencial.
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PCR en tiempo real (RT- PCR)

• El marcador de fluorescencia unido al primer en
  forma de complejo probe- pimers, la etapa 2 de
  alineación estos se unen a la cadena simple de
  ADN y en la 3ra, de extensión la actividad de la
  Taq polimerasa ataca degrada el primer y libera
  el marcador del primer, liberándose del complejo
  y emitiendo entonces la fluorescencia.

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Control interno PCR en tiempo real (RT- PCR)

• Existen genes constitutivos (de expresión
  permanentes) que sirven de referencia para el
  RT-PCR. qPCR (PCR cuantitativo) y qRT-PCR,
  llamados Housekeeping genes o genes de
  referencia.
• Sabiendo el ritmo de expresión de estos genes
  tenemos un punto de comparación para calibrar y
  estandarizar los resultados.
• En el diagnostico de COVID-19 generalmente se
  emplea el gen de la ß- actina como referencia.

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Pasos de procesamiento de la muestra para
diagnóstico de SARSCoV - 2

1. Toma de la muestra
2. Almacenamiento de la muestra
3. Transportación de la muestra
4. Procesamiento de la muestra
5. Preparación de reactivos
6. Adición de la muestra
7. PCR en tiempo real

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• Toma de la muestra Exudado faringeo rotar
  rapidamente en el istmo de las fauses en ambos
  pilares palatoglosos, garganta y amigbalas,
  aplicando presion para recoger tanata secrecion
  como sea posible.
• Almacenamiento de la muetra Se de almacenar a
  -18C por menos de 1 semana y a -70? por no mas
  de 6 meses. La muestra se almacena de 2 a 8C
  hasta 72 horas luego de la toma. Si está
  congelada a -70 o C o menos poner en hielo seco.
  Los ácidos nucleicos extraídos se almacenan a -70
  ºC o menos.
• Transportacion de la muestra Debe permanecer a
  bajs temperature empleando por ejemplo hielo seco
• Procesamiento de la muestra
• Preparacion de reactivos

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Interpretación de la prueba
OBSERVACION CON FLUOROSFORO VIC OBSERVACION CON FLUOROSFORO FAM Resultado
MUESTRA 1 Curva sigmoidal y Ct menor que 35 Curva sigmodal con Ct menor que 37 POSITIVO
MUESTRA 2 Curva sigmoidal y Ct menor que 35 Curva sigmodal con Ct mayor que 37 NEGATIVO
MUESTRA 3 Curva sigmoidal y Ct mayor que 35 El resultado es inconsequente dado que el control interno falló PRUEBA INHIBIDA
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En el diagnóstico de COVID19, usualmente Ct 40
ciclos, valor menor indica que con menos
amplificación se produce la misma fluorescencia
por lo que la carga viral es alta y si el valor
es mayor traduce que hay menor material genético.
Esta muestra es negativa para el SARSCov-2.
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(No Transcript)