MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES m

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - spectrophotométriques

• SPECTROPHOTOMETRIE DABSORPTION MOLECULAIRE
• Principe
• Utilise la capacité dabsorption de lumière dune
  longueur donde fine et définie des
• substances dissoutes dans leau.
• Loi de Beer-Lambert (en expression
  logarithmique) 
• Log I0 /I e . C .L densité optique ou DO
  (directement proportionnelle à C)
• I énergie lumière transmise
• I0 énergie lumière incidente
• C concentration substance en mole/l dans le
  solvant
• L longueur du trajet optique (largeur de la
  cuve)
• e coefficient caractéristique de la longueur
  donde (coef. dabsorption moléculaire)
• Si II0 -gt le milieu est transparent, la
  transmission est de 100 et la DO 0
• Si I tend vers 0 , milieu opaque, la DO tend vers
  linfini
• Spectre dabsorption lumineuse 
• représentation graphique des variations de
  densité optique de la lumière transmise
• lors de modification de la longueur donde de la
  lumière incidente.
• Spectres des substances  ultraviolet et visible.
• Conditions définies  solvant, pH, O sinon
  variation de lemplacement des longueurs

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - spectrophotométriques

• SPECTROPHOTOMETRIE DABSORPTION MOLECULAIRE
• Appareillage
• Nature
• spectrophotomètres  toutes les longueurs dondes
  sont disponibles
• Photomètres  certaines longueurs dondes
• Caractéristiques
• Sources lumineuses
• solides chauffés (tungstène ,
  visible-infrarouge)
• (halogène, visible-UV)
• décharges des gaz raréfiés (hydrogène ou
  deutérium( UV, continu)
• (vapeur de mercure (UV, discontinu)
• Fente dentrée forme rectangulaire
• Mono chromateur filtres colorés (verre ou
  gélatine)
• Filtres interférentiels (verre métal)
• Prismes (dispersion de la lumière)
• Réseaux (idem)
• Fentes de sortie

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - spectrophotométriques

• SPECTROPHOTOMETRIE DABSORPTION MOLECULAIRE
• Appareillage
• Caractéristiques
• Cuves verre -gt visible
• Quartz -gt U.V.
• polystyrène
• Précautions dutilisation (bulles,
  rayures,nettoyage)
• Cellules photoélectriques -gt transformation
  énergie lumineuse en énergie électrique
• Tubes photomultiplicateurs
• Lentilles, miroirs, fibres optiques
• Amplificateurs
• Galvanomètres (mesure le courant fourni par
  lamplificateur)
• Enregistreur
• Appareils
• photomètres  à filtres, peu coûteux
• spectrophotomètres  à réseaux ou à prismes
  (intéressants pour les spectres)

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - spectrophotométriques

• SPECTROPHOTOMETRIE DABSORPTION MOLECULAIRE
• Applications
• Détermination du spectre ?caractérisation
  substance
• Mesure de concentration directe (Hb. Protéines)
• Indirecte (urée ?diacetylmonoxime)
• Réflectométrie
• Mesure de labsorption lumineuse au cours du
  passage dune lumière
• monochromatique à travers une phase solide sur
  support réfléchissant.
• Applications Lecture de plaques de
  chromatographie, de bandelettes réactives
• Analyse automatique
• Luminométrie
• Mesure de la lumière émise par réaction chimique
  (Chimioluminescence)
• Applications  réactions impliquant la
  luciférase (ATP ou O2)

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - spectrophotométriques

• PHOTOMETRIE DES MILIEUX TROUBLES
• Opacimétrie
• mesure de la lumière émise dans le même sens que
  la lumière incidente
• Néphélémétrie
• mesure de la lumière à 90 par rapport à la
  direction de la lumière incidente
• Turbidimétrie
• concentration ou épaisseur dun milieu troublant
  la visibilité nette dun test optique placé
  derrière ce milieu
• FLUORIMETRIE
• Principe  une molécule à létat stable recevant
  une énergie sous forme de rayonnement passe à
  létat excité. Le retour à létat fondamental se
  traduit par lémission de lumière mesurable.
• CHEMILUMINESCENCE
• Dans ce cas, lénergie est dorigine chimique ou
  enzymatique
• Spectres
• démission comporte une longueur donde pour
  laquelle lintensité est maximum
• dexcitation comporte une longueur donde pour
  laquelle lintensité est maximum

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - spectrophotométriques

• SPECTROMETRIE DABSORPTION ATOMIQUE
• Principe
• Mesure de labsorption de radiations photoniques
  spécifiques par des atomes en
• phase vapeur
• Loi de Kirchhoff un élément métallique peut
  absorber les radiations quil est lui-même
• susceptible démettre
• Atome métallique énergie lumineuse ? état
  excité
• Retour à létat fondamental ?radiations
  caractéristiques (raie de résonance)
• Inversement
• Vapeur atomique (atomes état fondamental)
  radiation ? absorption de la radiation
• Appareillage
• Sources de radiation lampe à cathode creuse ou
  lampes à excitation HF
• Production de la vapeur atomique source
  datomisation à flamme ou électrothermie
• Systèmes de correction dabsorption non
  spécifique
• Système de lecture monochromateur puis
  photomultiplicateur
• Applications
• Dosage des métaux et alcalinoterreux (biologie
  clinique, toxicologie, pharmacologie)

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - spectrophotométriques

• PHOTOMETRIE DEMISSION ATOMIQUE
• Principe
• Mesure de lintensité dénergie lumineuse
  spécifique émise par un élément chauffé dans
• une flamme (raie de résonance)
• Appareillage
• Nébuliseur brûleur (solution à doser nébulisée
  dans une flamme (air-propane,acétylène)
• Système de lecture filtre interférentiel à
  bande étroite dispositif photosensible
• Applications
• Dosage des alcalins Na, K, Li (biologie clinique)
• Inconvénient
• Manipulation des gaz
• Avantages
• Fiabilité, spécificité, linéarité, simplicité

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Spectrophotomètres Schéma
9
(No Transcript)
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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques

• METHODES ELECTROCHIMIQUES
• Principe
• Echange délectrons entre électrode et substance
  électroactive
• (électrode cathode ou anode)
• Méthodes
• Méthodes en pleine expansion, souvent
  automatisables (biochimie analytique du GR ou
  analyses de biologie délocalisée)
• Les méthodes sont de 2 types selon limportance
  de lélectrolyse 
• ? ampérométrique 
• ampérométrie  microélectrolyse avec
  concentration relativement constante de
• lanalyte. Potentiel constant, intensité courant
  proportionnelle à concentration
• Analyte - Application  détermination de la PO2
  ou étude post-chromatographique
• haute pression.
• potentiométrie  les électrodes sont spécifiques
  à membrane. Intensité courant
• constante,analyse des variations de potentiel en
  fonction de la concentration analyte
• ? coulométrique  coulométrie
• mesure la consommation complète du produit à
  analyser. Intensité ou potentiel
• imposé. - Application  dosage du fer sérique par
  coulométrie à potentiel imposé.
• ? voltamétrie et polarographie. Application peu
  usuelle

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques

• RADIOANALYSE
• Principe
• La plupart des éléments naturels existent à
  létat de mélange disotopes
• Masse noyau ? et Nombre électron ?propriétés
  chimiques identiques
• Les radioisotopes sont instables.
• Leur désintégration ? libération e- ou rayon g
• Il est possible de créer des réactifs marqués par
  radioisotopes pour lusage biologique.
• Méthodes
• Les radioisotopes peuvent être détectés de
  diverses manières 
• - compteur Geiger (ionisation dun gaz)
• - compteur à scintillation (éclair lumineux)
• - autoradiographie (impression dune plaque
  photographique)
• Applications
• - toute technique danalyse biochimique (cf 
  reste du cours !)
• - étude métaboliques  traçage des processus
  cellulaires 
• précurseur radioactif , étape métabolique, mesure
  biochimique , autoradiographique,..

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie

• Enzyme
• Définition catalyseur biologique de réaction
  biochimiques
• Spécificité vis à vis de la molécule sur laquelle
  il agit substrat
• Variable (notion daffinité)
• Structure
• Préparation et purification
• Protéines 
• Parfois fragilisées par les séparation des
  constituants cellulaires
• Site actif sites privilégiés de fixation du
  substrat
• Proenzyme forme inactive à transformer pour
  activation
• Isoenzymes différentes protéines à même
  spécificité enzymatique correspondent
  souvent à des protéines formées de plusieurs
  chaînes polypeptidiques à combinaisons
  variables entre elles (LDH)
• Il existe des protéines à plusieurs fonctions
  enzymatiques
• Enzyme et structure cellulaire
• - enzymes impliquées dans une chaîne métabolique
  ont souvent la même localisation cellulaire
• parfois regroupements en complexes
  poly-enzymatiques difficilement dissociables

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie

• Enzyme
• Régulation de lactivité enzymatique
• Formes allostériques ?différences de forme
  spaciale
• Certaines substances - ligands- modifient ces
  formes
• Ce sont des effecteurs allostériques (parfois
  substrat dans ce cas la courbe de la
• vitesse de réaction en fonction de la
  concentration prend la forme dune sigmoîde)
• Certaines substances de bas PM ont également des
  effets effecteurs ou inhibiteurs ? modification
  de laffinité pour le substrat ?régulation
  métabolique
• Cas de la régulation par le produit terminal de
  la chaîne métabolique rétro inhibition ou
  inhibition par feed-back
• Enzyme à concentration faible par rapport aux
  autres enzymes de la chaîne métabolique, enzyme
  régulateur de la chaîne ? effet limitant
• Classification internationale des enzymes gt
  numérotation
• 1 oxydoréductases  réactions doxyoréduction
• 2 transférases  transfert de groupements
  fonctionnels
• 3 hydrolases  réactions dhydrolyse
• 4 lyases  suppression ou fixation dun
  groupementgtdouble liaison
• 5 isomérases  réactions disomérisation
• 6 ligases  liaison (c-o, c-n, c-c, c-s) avec
  coupure dune molécule dATP

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie

• Dosage des enzymes
• Moyens méthodes immunochimiques (comme autres
  protéines, cf suite du cours)
• méthodes de mesure de lactivité catalytique
• Mesure quantitative (activité catalytique)
• Mesurer la vitesse de réaction ? apprécier la
  quantité denzyme
• v kEnz
• v molécules de substrat tranformées par minute
• Enz concentration en enzyme
• k constante dépendant de la nature de lenzyme
• Paramètres
• concentration en substrat
• mesure, pour chaque concentration, de la vitesse
  initiale (tous paramètres stables)
• aspect de la courbe dû au fait que, à
  concentration faible, toutes les molécules
  denzyme ne sont
• pas saturées
• pour une concentration en substrat la vitesse est
  donnée par 
• équation de Michaelis-Menton v Vmax S / S
  KM
• KM  caractéristique de lenzyme, exprimée en
  molécules.l-1
• Souvent transformation pour obtenir une
  représentation graphique linéaire (équations de

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méthodes analytiques - enzymologie
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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie

• Dosage des enzymes
• Paramètres
• Température et pH résultante entre effets
  activateurs et inhibiteurs
• Coenzymes partie non protéique souvent
  transformé lui-même
• souvent transporteur de groupements
  fonctionnels
• ATP, coenzymeA, biotine, pyrophosphate de
  thiamine
• Activateurs autres  ions métalliques (Zn, Mg..),
  protéines inertes (albumine)
• protecteurs des thiols
• Inhibition compétitive analogue structural du
  substrat
• modification par ajout de substrat
• modification de la KM
• non compétitive complexants,
• inhibiteurs dune fonction chimique
• aucun effet dajout de substrat
• pas de modification de la KM
• ? nécessité de standardisation, de contrôles
  interne, externes

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie
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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie
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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - enzymologie

• Dosage des enzymes
• conditions classiques
• large excès de substrat
• température 37 ou 30
• pH pH optimal
• protecteurs enzymatiques
• dilutions ( !)
• Expression des résultats
• v de la réaction / ml ou mg de protéines
• v mmoles de substrat / mn à 30 ? UI
• Katal 1 mole/seconde
• 1 UI 16 nkatal

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques

• Dosage des enzymes
• Techniques de mesure
• 2 possibilités  disparition du substrat ou
  apparition du produit
• méthodologies de mesure
• photométrie coloration du produit , différence
  dabsorption
• fluorimétrie technique plus sensible,
• soit fluorescence spontanée, soit
  transformation par
• modification pH, ajout réactif, transformation
  structure
• causes derreurs (fluorescence propre ,
  impuretés? témoin  blanc réaction )
• radioisotopie substrat radioactif ? séparation
• sensible, peu dinterférences
• impossibilité dautomatisation
• prix élevé, difficultés de fabrication
• Immunochimie Anticorps-anti-enzyme pour séparer
  différentes activités
• Spécificité pour une isoforme
• Etude des modifications génétiques

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques

• Dosage des substrats
• Dosages en point final
• Excès denzyme
• Possibilité dutiliser une deuxième réaction de
  révélation
• Mesure en fin de réaction par photométrie ou
  radioenzymologie
• Dosages par méthode cinétique
• Enzyme à Km élevée (éventuellement inhibiteur
  compétitif)
• Mesure de la vitesse de réaction à 2 temps
  rapprochés et comparaison avec la courbe établie
  à partir de quantités connues de substrat
• La plupart du temps  méthodes des analyseurs
  multiparamétriques

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques
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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques
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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - immunochimie

• Principe 
• utilise la spécificité remarquable de la liaison
  antigène anticorps due à la
• complémentation stéréochimique qui la caractérise
• Nature des réactifs
• Anticorps protéine particulière synthétisée par
  les lymphocytes B
• Architecture de base à 2 chaînes lourdes et
  légères
• Polymorphisme très élevé
• Site Ac toujours situé en extrémité N
  terminale
• Liaison Ag-Ac par site antigénique et site
  anticorps
• Chaque anticorps possède une afffinité
  particulière à légard de lépitope qui lui
  correspond
• Antigène Nombre dépitopes variable de 1 pour
  les molécules
• hapténiques à plusieurs centaines pour
  certains virus

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - immunochimie

• Préparation des réactifs immunochimiques
• Immunisation expérimentale danimaux la plupart
  du temps
• Préparation des antigènes
• Grosses molécules spontanément immunogènes
  ?injection directe
• Haptènes molécules PM lt5000 ? couplage avec
  grosses molécules (albumine, adjuvant de Freund)
• Préparation des anticorps
• Anticorps polyclonaux
• Mélange danticorps issus de nombreuses cellules
  lymphoïdes ? Ac reconnaissant
• des épitopes différents ou des aspects variés du
  même épitope ou un même épitope
• avec une affinité variable immunsérums,
  excellents réactifs
• Nécessité de purifier limmunsérum
• de le concentrer en anticorps (précipitation
  Ig)
• Anticorps monoclonaux
• Proviennent de lhybridation dune cellule
  lymphocytaire avec une cellule tumorale
• (plasmocytome) gtcellule hybride immortelle
• gtclone à fabrication indéfinie et stabilisée d1
  anticorps
• avantages  production industrielle
• préparation à partir dantigènes inconnus

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - immunochimie

• Etalonnage
• Réaction Ag-Ac sensible à lenvironnement ?
  étalonnage et dosage mêmes conditions
• (y compris nature du prélèvement)
• En général, il est en fait techniquement
  impossible de connaître la quantité exacte
• dantigène dans le milieu détalonnage
• gt expertises et définitions dunités
  internationales
• distribution de solutions détalonnage sous les
  auspices de lOMS
• Méthodes
• Nombre et variété impressionnants
• Classification possible selon le phénomène
  observé et mesuré
• Observation directe du complexe Ag-Ac 
  précipitation, agglutination
• Observation indirecte par lintermédiaire dune
  marque attachée soit à lantigène, soit à
  lanticorps. Marque molécule détectable par un
  appareil ou les sens.
• Observation par intermédiaire dun phénomène
  biologique
• Applicables à la quantification des antigènes et
  des anticorps
• mais
• dosage possible des antigènes (cf  remarques)
• Seulement estimation des anticorps (variabilité)
• Appréciation de la quantité des immuncomplexes

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - immunochimie
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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - immunochimie

• Standardisation et contrôles de qualité en
  immunochimie
• Valeurs des méthodes inégales 
• Reproductibilité
• seuil de détection
• Spécificité
• sensibilité aux interférences
• Commodité
• capacité à être automatisée
• coût
• Donc  évaluations, comparaisons
• généralement du mélange  principe
  méthodologique, appareillage, réactifs
• standardisation en fait impossible
• ? définition de valeurs de consensus
• ? mise au point de matériel réactif de référence

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques observation
microscopique

• Principe
• Utilisation damplification du signal par
  lentilles optiques pour détecter des objets de
• taille inférieure à celle décelable à
  lobservation à lœil nu.
• Méthodes
• On distingue 
• la microscopie photonique qui, comme son nom
  lindique, utilise des lampes à
• émission de photons (longueurs dondes UV
  visibles).
• Préparation spéciale coloration sélective
  (entraîne la nécessité daugmenter la
• sensibilité par activité enzymatique ou par
  fluorescence)
• ? le microscope à fluorescence permet la
  détection de protéines ou dautres substances.
• Il est possible dutiliser des anticorps marqués
  (fluorescents ou révélés par activité
  enzymatique). Ces anticorps se lient à la surface
  des molécules de la cellule vivante ou à
  lintérieur de la cellule fixée perméabilisée. Il
  y a possibilité de détection de variation de
  concentration et localisation de molécules à
  lintérieur de la cellule.
• ? la microscopie par diffraction des rayons X 
  révèle un arrangement tridimensionnel moléculaire.

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques observation
microscopique

• Méthodes
• la microscopie électronique qui utilise un
  faisceau délectrons.
• Contraintes spécifiques 
• la fixation est nécessaire (elle utilise en
  général des produits identiques à ceux
• décrits pour la déprotéinisation)
• coupe en tranches fines (souvent inclusion dans
  résine ou cire)
• les mêmes préparations avec révélation (enzyme,
  peroxydase ou or colloïdal) utilisées pour la
  microscopie optique peuvent être utilisées en
  microscopie électronique
• La microscopie électronique par cryofracture
  (cassure des structures internes de la
• cellule par le froid intense) localise la
  distribution de proteines intra-cellulaires.
• La technique de coloration négative  entraîne la
  révélation dagrégats
• macromoléculaires ou lagencement des sous-unités
  protéiniques.

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques observation
microscopique
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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques observation
microscopique
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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
valeurs

• Mesure dun paramètre biologique chez un individu
• ?
• Valeur
• à situer par rapport aux valeurs possibles
• donc nécessite que soient connues
• Les valeurs représentatives de la population
  générale
• Les valeurs de référence
• Individus en bonne santé
• Conditions définies (exclusion des facteurs de
  variation)
• Les valeurs usuelles
• Population hétérogène (existent des facteurs
  incontrôlés)
• Population pathologique à risque (obèses)
• Valeurs usuelles deviennent valeurs de référence
• si définition de la population et contrôle des
  facteurs dinterférence

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
valeurs listes des facteurs de variations
biologiques

• Le choix des individus de la population de
  référence impose de connaître
• les facteurs de variations biologiques
• Etablissement de la liste constitution de
  banques de données
• ?
• Répertorier
• Littérature
• Facteurs physiologiques
• Facteurs pharmacologiques
• Quantifier
• Centres dexamens de santé
• Variations tissulaires physiologiques
• Variations pharmacologiques et pathologiques

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
valeurs listes des facteurs de variations
biologiques

• Types de facteurs de variations biologiques
• Plusieurs propositions de classifications
• Variations génétiques ou acquises
• Variations dues à lenvironnement
• Variations dues à des facteurs exogènes ou
  endogènes
• Variations dues à des facteurs physiologiques
• Facteurs de masse (graisse, muscle, foie ?
  enzymes)
• Facteurs métaboliques
• Très régulés
• Produits de catabolisme
• Produits impliqués dans les mécanismes de
  synthèse à partir du plasma (glucose,
  cholestérol)

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
valeurs - sélection de la population de
référence

• La sélection de la population de référence
  utilise 2 types de critères
• ?Les critères de stratification ou facteurs de
  variation maîtrisables
• ?
• création de sous ensembles homogènes
• personnalité des groupes
• environnement
• histoire
• En général âge, sexe, masse corporelle,
  origine ethnique
• ?Les critères dexclusion ou facteurs de
  variation non maîtrisables
• pathologies
• prise de médicaments
• état physiologique
• sujets à risque

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
valeurs le concept de valeur de référence

• Filiation entre les différents termes

Individus de référence
Constituent la
Population de référence
À partir de laquelle est sélectionné un
Échantillon de référence
Valeur observée chez un individu
Sur lequel on détermine des
Pouvant être comparée aux
Valeur de référence
Sur lesquelles on observe une
Distribution de référence
À partir de laquelle est déterminée une
Limite de référence
Qui sert à définir l
Intervalle de référence
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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
valeurs le concept de valeur de référence

• 
  

Études bibliographiques et expérimentales
Liste des facteurs de variations biologiques et
pathologiques
Sélection des sujets
à posteriori
à priori
Critères de stratification, dexclusion
population de référence
Préparation des sujets
Préparation des sujets
questionnaire
Prélèvement Traitement du spécimen analyse
Prélèvement Traitement du spécimen analyse
Sélection de léchantillon de référence Critères
de stratification, dexclusion
Traitements statistiques
Traitement statistique Vérification de la
représentativité
Valeurs de référence
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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - publication

• ELEMENTS D'UN ARTICLE SCIENTIFIQUE
• journal
• Date de parution
• titre
• Auteurs adresses
• Mots clefs
• résumé
• introduction
• Exposé du problème à résoudre
• Etat des connaissances
• Plan du travail
• Matériels (techniques et biologiques) et méthodes
• Résultats commentaires (Tableaux Figures)
• Discussion (Tableaux Figures)
• conclusion
• remerciements
• bibliographie

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - publication (X linked
recessive icthyosis)

• MATERIEL BIOLOGIQUE UTILISE
• ? biopsie cutanée ? fibroblastes cultivés
• ? sang ? leucocytes isolés
• METHODES UTILISEES
• culture cellulaire
• sédimentation en polyvinylpyrolidone
• centrifugation
• lyse cellulaire (ultrasons)
• mesure activité enzymatique
• ? radiochimie
• ? blanc réactif blanc réaction
• ? double essai
• ? mesure par fluorimétrie en substrat
  artificiel (méthylumbelliférone)

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques - publication (X linked
recessive icthyosis)

• RESULTATS
• blanc réactif (conditions d'incubation)
• conditions de réaction
• STS
• ? comparaison de tampon Tris et phosphate
• ? sensibilité dans les leucocytes ? temps
  incubation
• ? activité spécifique substrat
• ? concentration en protéines
• de l'échantillon
• ARS-C
• ? tampon phosphate à pH 8,5
• détermination des valeurs de référence
• ? des valeurs des patients
• ?des valeurs des porteurs
• CONCLUSION
• intérêt du dosage de la STS
• intérêt de la mesure dans plusieurs types
  cellulaires pour le dépistage
• des porteurs

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques publication
(purification microfibrilles

• MATERIEL BIOLOGIQUE UTILISE
• Ligaments de la nuque de fœtus de boeuf
• METHODES UTILISEES
• Préparation de microfibrilles natives intactes
  ( )
• Centrifugation en gradient de densité
• ? directement ou après traitement avec
  hyaluronidase toute la nuit
• ? en gradient de C3CL (densité initiale 1,35
  g/ml)
• soit ? 72 H, 36 000 rpm
• ? 15 fractions de 0,8 ml
• soit ? congélation4 H à -80C, 18 H
  centrifugation, 36 000 rmp
• ? 15 fractions de 0,8 ml
• Analyse biochimique
• ? dialyse contre tampon 50 mM Tris/HCL, pH
  7,4, contenant 0,2 M NaCl
• ? mesure densité optique à 280 nm par analyse
  spectrophotométrique
• SDS PAGE
• ? dialyse contre eau distillée (aliquot 0,5
  ml)
• ? congélation
• ? SDS PAGE à 6 de SDS en condition
  réductrice (dithiothreitol)
• ? coloration des protéines ou bleu de
  Coomassie

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MATERIEL BIOLOGIQUE et APPROCHES EXPERIMENTALES
méthodes analytiques publication
(purification microfibrilles)

• RESULTATS
• Centrifugation en gradient de densité
• ? gradients de 1,28 à 1,43 g/ml (72H ou 18H
  après congélation)
• ? mesure de la densité optique à 280 nm ?
  protéines à densité 1,30,
• 1,33 et 1,41 g/ml
• après traitement par hyaluronidase, pic
  protéines 1,33 et 1,37 g/l
• SDS PAGE et Immunobuvardage
• ? fractions 6 et 7 ? collagène VI chaîne ?1 et
  ?2 et chaîne ?3
• ? fractions11 et 12 protéine de 330 kDa ?
  fibrilline avec
• colocalisation MAGP-1
• ? sommet du gradient fractions 1 et 2 ? LTBP-1
  et LTBP-2
• Microscopie à ombrage rotatif
• - préparation non traitée à la hyaluronidase
• ? fractions 6 et 7 ? collagène VI en aggregats
• quelques fibres de fibrilline
• ? fractions 11 ? µfibrilles de fibrilline
• - préparation traitée à la hyaluronidase