Cincinnati Children's Hospital Medical Center

1
Atresia das vias biliares extra-hepáticas Express
ão gênica em um modelo experimental
Autora Elisa de Carvalho
Brasília - 2005
Orientador Luiz Alberto Simeoni
Co-orientador Jorge A. Bezerra
Universidade de Brasília
Cincinnati Children's Hospital Medical
Center
2
I - Introdução
3
AVBEH principal indicação de transplante hepático

4
AVBEH principal indicação de transplante hepático
AVBEH 50 dos transplantes hepáticos
pediátricos BALISTRERI, W. F. et al. Biliary
atresia current concepts and research
directions. Summary of a symposium. Hepatology
23, 1682-1692 (1996).
Nenhuma outra patologia, nem na idade adulta, é
responsável por essa monta de indicação para o
transplante.
5
AVBEH
Complicações da portoentorostomia
Complicações da doença
Colangite
Colestase
Progressão da hepatopatia
?
Hipertensão portal Cirrose biliar
Varizes esofagogástricas Hiperesplenismo Ascite In
suficiência hepática Síndrome hepatopulmonar Síndr
ome heparorrenal
6
Terapêutica portoenterostomia

7
Evolução pós-portoenterostomia
Diagnóstico tardio
8
(No Transcript)
9
Etiopatogênese
?
10
Etiopatogênese
Embrionária
Perinatal
20
80
11
Histologia das vias biliares
12
Obstrução progressiva das VBEH
13
Modelo animal AVBEH
Rotavírus rhesus do grupo A
PHILLIPS, P. A. et al. Chronic obstructive
jaundice induced by Reovirus type 3 in weanling
mice. Pathology 1, 193-203 (1969).
SCHMELING, D. J. et al. Experimental obliterative
cholangitis. A model for the study of biliary
atresia. Ann. Surg. 213, 350-355 (1991).
RIEPENHOFF-TALTY, M. et al. Group A rotaviruses
produce extrahepatic biliary obstruction in
orally inoculated newborn mice. Pediatr. Res. 33,
394-399 (1993).
PETERSEN, C. et al. New aspects in a murine
model for extrahepatic biliary atresia. J.
Pediatr. Surg. 32, 1190-1195 (1997).
Camundongos Balb/c
14
Modelo animal AVBEH
Rotavírus rhesus do grupo A
Indução AVBEH
Idade do animal
lt 12 horas
Camundongos Balb/c
Carga viral
Modelo animal bem estabelecido, como adequado
para pesquisas experimentais relacionadas à
atresia.
106 PFU/mL
Via de inoculação
Intraperitoneal
15
Modelo animal AVBEH
Rotavírus rhesus do grupo A
RRV
Expressão gênica
Fator inicial Infecção
Camundongos Balb/c
Inflamação e fibrose obliterante
As modificações da expressão gênica comandam os
processos biológicos que influenciam a evolução
da doença após o a lesão inicial.
16
Hipótese do estudo
Genoma
Inoculação de RRV
Ativação ou desativação reacional de genes
Reprogramação da função celular (Estimulação ou
inibição de processos biológicos)
Fibrose progressiva com obliteração das VBEH
17
II - Objetivos
18
Objetivo geral
Analisar o transcriptoma (expressão gênica) das
vias biliares extra-hepáticas, em modelo
experimental de AVBEH, nas diferentes fases da
evolução dessa doença.
19
Objetivos específicos
Identificar os genes ativados e os desativados,
nos camundongos infectados pelo RRV, em relação
ao grupo controle, nos diferentes estágios da
obstrução biliar.
Avaliar os processos biológicos que se
correlacionam ao desenvolvimento da atresia das
vias biliares extra-hepáticas.
Identificar e analisar as vias moleculares que
regulam o dano celular e a obliteração das
vias biliares extra-hepáticas.
20
III - Métodos
21
Desenho do estudo
Estudo experimental, randomizado e controlado.
22
114 camundongos Balb/c menores que 24 horas de
vida filhos de mães
negativas para o RRV
Grupo A (modelo animal de AVBEH) 63 camundongos
injeção intraperitoneal 1,5 x 106 UFF de
Rotavírus rhesus do grupo A (20 µL)
primeiras 24 horas de
vida
Excluídos animais do grupo A que não
desenvolveram AVBEH.
Grupo B (grupo controle) 51 camundongos
Injeção intraperitoneal 20 µL de soro
fisiológico 0,9,
primeiras 24 horas de vida.
23
102 Camundongos Balb/c (lt 24 horas de vida)
Inoculação intraperitoneal com RRV
Inoculação intraperitoneal com SF 0,9
Grupo B 51 camundongos (grupo controle)
Grupo A 51 camundongos (modelo animal de AVBEH)
Clínica peso, icterícia, colúria e acolia fecal
Laboratorial bilirrubinúria Anestesia
Microdissecção e ressecção das vias biliares
Retirada de dois fragmentos hepáticos
Animais sacrificados com 03 dias de vida
subgrupos A1 e B1 07 dias de vida subgrupos A2
e B2 14 dias de vida subgrupos A3 e B3
03 amostras RNA Microarranjos
03 amostras RNA RT PCR
03 amostras Histologia VB
Dia 3
Dias 7 e 14
Amostra 01
Amostra 01
24
Avaliação da expressão gênica
Microarranjos de oligonucleotídeos sistema
GeneChip
Reação em cadeia da polimerase em tempo real
Novas tecnologias
GeneChip permite a avaliação do transcriptoma
(perfil de funcionamento de todos os genes em
um momento específico - níveis de mRNAs dos
genes expressos) em um único ensaio.
RT PCR teste de maior acurácia para determinação
da expressão gênica.
25
Microarranjos de oligonucleotídeos sistema
GeneChip

Várias seqüências de nucleotídeos (representando
todo o genoma) são depositadas em uma superfície
de vidro (o chip) e cada oligonucleotídeo
configura uma sonda para um gene específico.
26

Extração RNA das vias biliares
Homogeneização e lise celular (TRIzol)
Fase da separação (fenol/clorofórmio)
RNA
Lipídeos Carboidratos Proteínas
Precipitação (isopropanol)
RNA
RNA
TRIzol Reagent Invitrogen Corporation Life
Technologies, NY, USA
27
Qualidade do RNA
28
Microarranjos de oligonucleotídeos sistema
GeneChip
Local de origem do sinal de fluorescência e a
intensidade deste identifica o gene em questão e
seu nível de expressão.
29
Quantificação do sinal de fluorescência sistema
GeneChip
Unidade de expressão pixel
30
Análise dos resultados do GeneChip GeneSpring

31
Análise dos resultados do GeneChip GeneSpring
Avaliação conjunta dos resultados de todas as
amostras. Comparação entre os grupos
experimental e controle. Avaliação
estatística. Classificação dos genes em funções
biológicas (Gene Ontology).
32
GeneSpring
Seleção estatística dos genes e dos processos
biológicos
O valor da expressão dos genes no GeneSpring é um
valor relativo (ou normalizado) em relação ao
controle.
Segunda etapa As amostras do grupo controle
foram usadas como valor basal. A intensidade do
sinal de cada gene no grupo experimental foi
dividida pelo valor do mesmo gene no grupo
controle, o que foi realizado separadamente para
os dias 3, 7 e 14.
Primeira etapa Média de todos os sinais da
expressão gênica. Este valor é dividido por cada
um dos sinais individualmente. Objetivo evitar
valores extremos.
Normalização Grupo experimental X Grupo
controle (Feito separadamente dias 3, 7 e 14)
33
GeneSpring
Seleção estatística dos genes e dos processos
biológicos
Genes ativados ou desativados gt 2x em relação ao
controle Genesativados ou desativados lt 2x em
relação ao controle
Seleção dos genes (Anova p lt 0,01)
Normalização Grupo experimental X Grupo
controle (Feito separadamente dias 3, 7 e 14)
34
GeneSpring
Seleção estatística dos genes e dos processos
biológicos
Sinal gerado pelo Affymetrix gt 100 pixels em pelo
menos duas das três amostras de cada
subgrupo (Diagrama de Venn)
Genes ativados ou desativados gt 2x em relação ao
controle Genesativados ou desativados lt 2x em
relação ao controle
Seleção dos genes (Anova p lt 0,01)
Normalização Grupo experimental X Grupo
controle (Feito separadamente dias 3, 7 e 14)
35
GeneSpring
Seleção estatística dos genes e dos processos
biológicos
Reclassificação dos genes (PubMed, GeneCard,
UniGene, Gene, GeneBank)
Seleção dos processos biológicos (Anova p lt 0,05)
Sinal gerado pelo Affymetrix gt 100 pixels em pelo
menos duas das três amostras de cada
subgrupo (Diagrama de Venn)
Genes ativados ou desativados gt 2x em relação ao
controle Genesativados ou desativados lt 2x em
relação ao controle
Seleção dos genes (Anova p lt 0,01)
Normalização Grupo experimental X Grupo
controle (Feito separadamente dias 3, 7 e 14)
36
Validação dos resultados do GeneChip
Reação em cadeia da polimerase em tempo real
37
RT PCR Quantificação do número de cópias

Sinal de fluorescência SYBR Green
38
Curva de amplificação da RT PCR com várias
amostras

39
Curva de amplificação da RT PCR e definição do CT

Platô
Linha que delimita o nível de detecção do sinal
de fluorescência
Amostra
Fluorescência emitida
Threshold
Amostra sem DNA
Região da linha de base
CT
Número de ciclos
Quantidade de cópias inicial da amostra
40
Cálculo da expressão gênica
Expressão de um gene
Quantidade de cópias do gene-alvo Quantidade de
cópias do gene padrão
Variação da expressão
Expressão do gene no grupo experimental
Expressão do gene
no grupo controle
Gene padrão 18S. Animais do grupo experimental
e do controle.
41
Especificidade dos microarrranjos árvore biliar
extra-hepática
Expressão da citoqueratina-7 (Krt2-7) Fígado e
árvore biliar extra-hepática
Validação RT PCR

42
IV - Resultados
43
Incidência de AVBEH animais infectados por RRV
63 camundongos
AVBEH 51 camundongos (81)
Outros estudos 67 a 86 Petersen C et al.,
1997 Czech-schmidt G et al., 2001 Shivakumar
P et al., 2004
44
Evolução da infecção pelo RRV
Icterícia Colúria Acolia fecal
AVBEH quadro clínico
Ausência Quadro diarréico
X
Humanos diarréia importante (O'ryan M. et al.,
2005) Animais mais velhos ausência de icterícia
(Feng N. et al., 1994)
45
Camundongos
RRV tropismo pelos colangiócitos
Brevidade cronológica
Não persiste com o crescimento e o amadurecimento
do animal
RRV tropismo único pelas células do epitélio
biliar neonatal (Shivakumar et al., 2004)
46
De modo similar em humanos Atresia é observada
apenas em lactentes nos primeiros três meses de
vida, não se desenvolvendo em crianças maiores ou
em adultos.
BALISTRERI, W. F. Neonatal cholestasis. J.
Pediatr. 106, 171-184 (1985).
BEZERRA, J. A. BALISTRERI, W. F. Cholestatic
syndromes of infancy and childhood. Semin.
Gastrointest. Dis. 12, 54-65 (2001).
Imaturidade temporária relacionada à idade
precoce Pode desempenhar um papel importante na
história natural dessa doença.
47
Aspecto macroscópico das vias biliares
extra-hepáticas

Vesícula biliar distendida .
Vesícula biliar pequena e contraída.
Vias biliares de aspecto normal.
Vias biliares estreitas e fibrosadas.
48
Avaliação histológica das vias biliares
Grupo controle
Dia 14
Dia 3
Dia 7
Grupo experimental
Dia 3
Dia 7
Dia 14
Barra preta 100 µm
49
Peso médio dos camundongos

SF 0,9 RRV

Peso médio dos camundongos relacionado aos dias
seguidos à inoculação com SF0,9 ou RRV, com p lt
0,01 dos dias 7 a 14.
50
Modelo animal Idade Sinais clínicos Aspectos
macroscópicos Histologia Evolução
ss
Hipodesenvolvimento Redução da ingesta
alimentar Esteatorréia
Fenótipo da AVBEH em crianças
51
Avaliação histológica do fígado
Grupo controle
Dia 3
Dia 7
Dia 14
Grupo experimental
Dia 3
Dia 7
Dia 14
52
Papel do vírus
RRV (vias biliares e tecido hepático)
identificado nos animais sacrificados com 7 dias
RRV (vias biliares e tecido hepático) Não foi
isolado naqueles sacrificados com 14 dias.
MACK, C. L. et al. Armed CD4 Th1 effector cells
and activated macrophages participate in bile
duct injury in murine biliary atresia. Clin.
Immunol. 115, 200-209 (2005).
SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic
bile ducts by lymphocytes is regulated by
IFN-gamma in experimental biliary atresia. J.
Clin. Invest 114, 322-329 (2004).
Efeito citopático direto do vírus
Potencial papel dos processos imunes na evolução
da doença.
Infiltrado linfocitário periductular Predomínio
linfócitos TH1 e CTLs.
SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic
bile ducts by lymphocytes is regulated by
IFN-gamma in experimental biliary atresia. J.
Clin. Invest 114, 322-329 (2004).
53
Transcriptoma das vias biliares
54
Transcriptoma das vias biliares (45.101 genes
transcritos)
Anova p lt 0.01 Genes ativados ou desativados lt 2x
ou gt 2x Sinal gerado pelo Affymetrix gt 100 pixels
849 genes
Seleção dos processos biológicos Anova p lt 0,05
3SF 3RRV 7SF 7RRV 14SF 14RRV
Alto Baixo
Árvore genética GeneSpring
E e
55
359 genes
Reclassificação funcional dos genes (PubMed,
UniGene, Gene, GeneCard, GeneBank)
Dia 3 Imunidade Enzimas Proteínas
estruturais Transporte Transcrição e tradução
Dia 7 Imunidade Enzimas Proteínas
estruturais Apoptose Transdução de sinais
Dia 14 Imunidade Enzimas Proteínas
estruturais Transcrição e tradução Transdução de
sinais
Ativados 310 genes (62)
498 genes
Dia 3
Dia 7
Dia 14
56
Classificação funcional dos genes ativados nos
dias 3, 7 e 14.
ll
Transdução de sinal Apoptose Transcrição e
tradução Transporte Proteína estrutural Enzima Imu
nidade
Dia 3
Dia 7
Dia 14 Genes ativados
Imunidade três etapas da pesquisa. Maior número
de genes ativados processos imunes no dia 7.
57
Imunidade
Dia 3
58
Fase precoce da lesão biliar (dia 3)

Imunidade adquirida
Imunidade inata
59
Imunidade inata
Células fagocitárias (neutrófilos e macrófagos)
Frações do complemento
Tyki
C1R
Ativação macrofágica
Ativação da cascata de complemento
60
Via do MHC da classe I para apresentação de
antígenos linfócito T CD8
TAP2, TAPBP
PSMB8
61
Via do MHC da classe I para apresentação de
antígenos linfócito T CD8

TAP2, TAPBP
PSMB8
H2-D1, H2-Q7, H2-K1, H2-T1, H2-T10
62
Via do MHC da classe I para apresentação de
antígenos linfócito T CD8


TAP2, TAPBP
PSMB8
Imunidade celular
H2-D1, H2-Q7, H2-K1, H2-T1, H2-T10
63
Etapas da imunidade adquirida
Ativação dos linfócitos
LY6A
LY6E
Dias após a exposição ao antígeno
64
Receptores dos interferons e ativação da via
clássica JAK-STAT
IRF9
IFIT1
65
Imunidade adquirida dia 3

• Processamento e apresentação do antígeno
• Aumento da expressão do MHC da classe I
• Fatores reguladores dos interferons
• Estimulação dos linfócitos T

Imunidade celular
Imunidade humoral
BEZERRA, J. A. et al. Genetic induction of
proinflammatory immunity in children with biliary
atresia. Lancet 360, 1653-1659 (2002).
66
Imunidade
Dia 7
67
Imunidade inata complemento
C1Qa, C1Qß
C1R Dia 3
C3aR1
68
Citotoxicidade mediada por anticorpos
Fc?RIIIA (CD16)
Fc?RIII (CD16)
Célula NK ativada
Célula NK
Ac liga-se ao antígeno na superfície do patógeno
Receptores Fc (NK) reconhecem os Ac
Sinalização para célula NK matar a célula-alvo
A célula alvo morre por apoptose
69
Via do MHC da classe II para apresentação de
antígenos linfócito T CD4
Catepsinas
Biossíntese do MHC da classe II
H2-A?, H2-A?1, H2-E?, H2-E?1
IFNG
Expressão anômala do MHC da classe II nos ductos
biliares lesão progressiva
BROOME, U. et al. Different expression of HLA-DR
and ICAM-1 in livers from patients with biliary
atresia and Byler's disease. J. Hepatol. 26,
857-862 (1997).
FENG, J. et al. The aberrant expression of HLA-DR
in intrahepatic bile ducts in patients with
biliary atresia an immunohistochemistry and
immune electron microscopy study. J. Pediatr.
Surg. 39, 1658-1662 (2004).
KOBAYASHI, H. et al. Hepatic overexpression of
MHC class II antigens and macrophage-associated
antigens (CD68) in patients with biliary atresia
of poor prognosis. J. Pediatr. Surg. 32, 590-593
(1997).
70
H2-A?, H2-A?1, H2-E?, H2-E?1
Receptores das células T e seus ligantes
Reconhecimento do antígeno
TCRB-V13
Redistribuição dos receptores e seus ligantes
Sinapse imunológica
71
H2-A?, H2-A?1, H2-E?, H2-E?1
Receptores das células T e seus ligantes
Reconhecimento do antígeno
TCRB-V13
LFA1
Redistribuição dos receptores e seus ligantes
Moléculas de adesão intercelular
Sinapse imunológica
Moléculas de adesão papel significativo na
reação inflamatória na atresia biliar, por
ocasionarem atração, retenção e ativação dos
leucócitos circulantes.
DILLON, P. W. et al. Differential expression of
the major histocompatibility antigens and ICAM-1
on bile duct epithelial cells in biliary atresia.
Tohoku J. Exp. Med. 181, 33-40 (1997).
DAVENPORT, M. et al. Immunohistochemistry of the
liver and biliary tree in extrahepatic biliary
atresia. J. Pediatr. Surg. 36, 1017-1025 (2001).
72
H2-A?, H2-A?1, H2-E?, H2-E?1
Receptores das células T e seus ligantes
TCRB-V13
LFA1
Reconhecimento do antígeno
Outro evento de sinalização intracelular é a
fosforilação das tirosinas, por tirosinas cinases
da família Src.
Redistribuição dos receptores e seus ligantes
CD45R
Determina a atividade de sinalização das cinases
da família Src.
HCK
Sinapse imunológica
73
H2-A?, H2-A?1, H2-E?, H2-E?1
Receptores das células T e seus ligantes
TCRB-V13
Reconhecimento do antígeno
LFA1
CD45R
Redistribuição dos receptores e seus ligantes
Dia 7
Componentes essenciais sinapse imunológica
Sinapse imunológica
Fundamental ativação dos mecanismos de
sinalização intracelular na ativação da célula T
Regulam a produção de citocinas.
74
Desenvolvimento das subpopulações das células
T
IL2RG
Ativação das células T
Principal citocina célula T naive.
Estágio inicial diferenciação da célula T
Proliferação e a expansão clonal das células T
naive
Crescimento e diferenciação das células T.
Polarização citocina
Subpopulações TH1 e TH2
Etapas do desenvolvimento dos linfócitos.
Pergunta predomínio TH1 ou TH2?
A proporção relativa dessas subpopulações é o
principal determinante das funções protetoras e
das conseqüências patológicas da resposta imune.
75
TH1 e TH2 citocinas e funções efetoras diferentes
IFNG
76
Ações biológicas do interferon gama
(A) Ativação de macrófagos, que passam a
apresentar maior atividade microbicida.
(B) Nas células B, promove a troca do isótopo
para anticorpos opsonizantes e fixadores de
complemento.
(C) Promove a diferenciação das células T CD4
naive para a subpopulação TH1 e inibe a
proliferação das células TH2.
(D) Aumenta da expressão das moléculas do MHC
das classes I e II.
77
TH1 e TH2 citocinas e funções efetoras diferentes
IFNG
Citocina estabelece a presença de atividade das
células TH1.
78
Receptores dos interferons e ativação da via
clássica JAK-STAT
IFNG

STAT1
CXCL10, TGTP, CXCL9, LY6C, IGTP, IFI1, IIGP1,
SAMHD1, AIF1 e genes do MHC das classes I e II
Aciona a transcrição dos genes induzidos pelos
interferons.
79
Dia 3
Dia 7
Fatores reguladores do interferon (IRF7 e IRF9)
Interferon gama Genes induzidos pelo Ifn?
Via molecular com genes correlacionados
Ativação temporal dos indutores do interferon em
fases precoces da lesão biliar, seguida da
expressão de uma rede molecular dirigida pelo
interferon gama, que conhecidamente polariza os
linfócitos em um perfil pró-inflamatório TH1.
80
Papel do interferon gama na obstrução das vias
biliares
SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic
bile ducts by lymphocytes is regulated by
IFN-gamma in experimental biliary atresia. J.
Clin. Invest 114, 322-329 (2004).
MACK, C. L. et al. Armed CD4 TH1 effector cells
and activated macrophages participate in bile
duct injury in murine biliary atresia. Clin.
Immunol. 115, 200-209 (2005).
Modelo animal
Camundongos knock out para essa citocina
importância do interferon gama no desenvolvimento
da obstrução biliar.
Aumento da produção do interferon gama pelos
linfócitos TH1 e elevação do TNF-a produzido
pelos macrófagos.
BEZERRA, J. A. et al. Genetic induction of
proinflammatory immunity in children with biliary
atresia. Lancet 360, 1653-1659 (2002).
MACK, C. L. et al. Biliary atresia is associated
with CD4 TH1 cell-mediated portal tract
inflammation. Pediatr. Res. 56, 79-87 (2004).
Crianças
Aumento do interferon gama e do osteopontin,
sinalizando a resposta TH1, bem como a
desativação dos genes relacionados às
imunoglobulinas.
Perfil de citocinas característico da presença de
linfócitos TH1, a saber IL-2, interferon gama,
TNFa e IL-12.
81
Transcriptoma dia 7
IFNG
TNFRSF1ß, TNFaIP2
Mediador da resposta inflamatória
Fagócitos mononucleares ativados, células T
estimuladas por antígenos, células NK e
mastócitos.
82
Enzima
Dia 7
83
Via do MHC da classe II para apresentação de
antígenos linfócito T CD4
Catepsinas
Biossíntese do MHC da classe II
H2-A?, H2-A?1, H2-E?, H2-E?1
CTSC, CTSS
Processamento do antígeno
Expressão coordenada de genes co-relacionados
84
Apoptose
Dia 7
85
Mediadores da apoptose exocitose de grânulos
GZMA GZMB
Papel CTLs
Lise das células-alvo
86
Mediadores da apoptose mediada por FasL-Fas
CASP8
Expressão do FasL no epitélio dos ductos biliares
pode participar da lesão progressiva dos ductos
biliares intra-hepáticos após a portoenterostomia.
LIU, C. et al. Expression of fas ligand on bile
ductule epithelium in biliary atresia--a poor
prognostic factor. J. Pediatr. Surg. 35,
1591-1596 (2000).
87
Histologia das VBEH X transcriptoma biliar
88
Imunidade
Dia 14
89
Ativação Metabolismo do ferro
HAMP1
Maior ativação gênica
LCN2
Diminuem a disponibilidade de ferro e, por isso,
além de agirem como fatores de defesa, também
podem ser responsáveis pela anemia da inflamação
ou doença.
Desativação Recrutamento de linfócitos
CCL21A
VAP1
Silenciamento diminuição dos processos imunes no
dia 14
90
Transdução de sinais
Dia 14
91
Silenciamento de genes
Transdução de sinais relacionados à imunidade
92
Fatores de transcrição das células T
93
Sinalização intra-celular ativação dos fatores
de transcrição das células T
MAP2K5
RHOB
JUN
94
Sinalização intra-celular ativação dos fatores
de transcrição das células T
FKBP5
95
Sinalização intra-celular ativação dos fatores
de transcrição das células T
NF-?B regula a expressão de muito genes
relacionados à resposta inflamatória/imune.
Sinergismo com o STAT1 sinalização da resposta
aos interferons.
Inibição química desse fator preveniu a
obstrução biliar secundária ao RRV.
FENG, J. et al. Rotavirus-induced murine biliary
atresia is mediated by nuclear factor-kappaB. J.
Pediatr. Surg. 40, 630-636 (2005).
96
Via molecular coordenada por genes
co-relacionados
Desativação das vias responsáveis Produção do
AP-1 Ativação do NFAT
97
Proteínas estruturais
98
Desativados

Matriz extracelular Dia 7 FBN2, ADAMTS5,
COL4A5, COL14A1, PCOLCE, SPARCL1, FGFR1, GSN,
MFAP2, OGN Dia 14 COL4A5, COL16A1, FBLN1, FMOD,
FLRT3
Alta expressão morfogênese, fibrinogênese e
remodelamento da matriz extracelular. CHEN, L.
et al. Altered expression of genes involved in
hepatic morphogenesis and fibrogenesis are
identified by cDNA microarray analysis in biliary
atresia. Hepatology 38, 567-576 (2003). CHOE, B.
H. et al. The pattern of differentially expressed
genes in biliary atresia. J. Korean Med. Sci. 18,
392-396 (2003).
Pequena quantidade de células viáveis nas fases
tardias da obstrução biliar.
Exclusão de segmentos atrésicos durante a
ressecção da árvore biliar extra-hepática.
Microscópio de captura a laser de alta resolução.
99
Validação dos resultados dos microarranjos pela
RT PCR
100
Curva standard expressão gênica
Curva standard do gene Irf9
101
RT PCR curva de dissociação
Curva de amplificação do gene Stat1, das 18
amostras
102
Resultados do RT PCR
Genes escolhidos para validação dos resultados
dos microarranjos IRF7, IRF9, IFNG, IGTP, STAT1,
CXCL9 e CXCL10

103
Quantificação da expressão gênica nos
microrarranjos e na RT PCR

Diferença no grau de ativação A RT PCR apresenta
maior acurácia e sensibilidade em relação aos
microarranjos de oligonucleotídeos, tendo também
maior reprodutibilidade. DING, C. CANTOR, C. R.
Quantitative analysis of nucleic acids--the last
few years of progress. J. Biochem. Mol. Biol. 37,
1-10 (2004).
Resultados da RT PCR
Validam os obtidos nos microarranjos (GeneChip)
Confirmam a existência do circuito inflamatório
associado ao interferon gama.
Polarização para a resposta imune adquirida TH1.
104
Especificidade dos microarrranjos
33,1
1,2
Fígado Vias biliares
Citoqueratina-7 (KRT2-7) filamento presente nos
colangiócitos
105
Em resumo...
106
Histologia das VBEH X transcriptoma biliar
Papel do sistema imune
Interferon gama, TH1
Lesão e na obstrução das vias biliares
Alvos de intervenção terapêutica?
107
Fase precoce
Aumento da expressão do MHC da classe I
Moléculas processamento de antígeno para MHC da
classe I
Fase tardia
Aumento da expressão do MHC da classe II
Moléculas processamento de antígeno para MHC da
classe II
Moléculas sinapse imunológica
108
Novos achados
Apoptose
Ativação da cascata do complemento
Citotoxicidade mediada por anticorpos
109
VI - Conclusões
110
O transcriptoma da árvore biliar demonstrou a
presença predominante de um processo
pró-inflamatório, neste modelo experimental da
atresia de vias biliares extra-hepáticas, com
ativação reacional de genes em períodos
específicos da progressão do processo
obliterativo.
Notavelmente, os animais portadores de AVBEH
apresentaram ativação do interferon gama e a
expressão seqüêncial de uma rede hierárquica de
genes relacionados à essa citocina, o que reflete
um predomínio da resposta TH1.
111
A ativação de outros processos biológicos
relacionados à apoptose, à cascata de
complemento, à ADCC e aos fatores epigenéticos
demonstra a presença dessas vias metabólicas
durante o desenvolvimento da doença.
Coletivamente, esses genes formam uma seleção
transcricional altamente importante para a
direção de estudos futuros, que possam explorar
como genes individuais ou grupo de genes
relacionados entre si podem regular o início da
lesão biliar, bem como a progressão para
obliteração das vias biliares.
A definição dos papéis de cada componente desse
circuito inflamatório deve contribuir para a
elucidação dos mecanismos etiopatogênicos da
AVBEH e para o advento de novas opções
terapêuticas que influenciem na evolução da
doença, no prognóstico do paciente e na
necessidade do transplante hepático.
112
Autores
Elisa de Carvalho Cong Liu Pranavkumar
Shivakumar Gregg Sabla Bruce Aronow Jorge A.
Bezerra
113
Se consegui enxergar mais longe é porque estava
apoiado sobre os ombros de gigantes. Isaac
Newton, Matemático Inglês.
Obrigada!
114
Processos imunes Enzimas Dia 7
? USP18 imunidade inata. ? SLFN4 crescimento e
desenvolvimento das células T. ? OASL2, OAS1G e
OAS2 atividade antiviral, induzida pelos
interferons. ? GBP1, GBP2 e GBP3 proteína
ligadora de GTP com atividade GTPase, induzida
pelo interferon gama durante ativação
macrofágica. ? GZMA apoptose. ? PSMB8, PSMB9 e
PSMB10 processamento de antígeno para o
MHC da classe I. ? SAMHD1 induzida pelo
interferon, proteína de ligação ao GTP. ? CTSS e
CTSC proteólise, processamento do antígeno e
geração de peptídeo para o MHC da classe II. ?
CYBB, CYP1B1, CYBA, NCF1 e NCF2 complexo NADPH
oxidase (fagocitose). ? PLA2G7 ativa os
neutrófilos polimorfonucleares e aumenta a
permeabilidade vascular. Atua na inflamação e na
anafilaxia. Produzido por plaquetas, leucócitos e
células endoteliais. ? HCK membro da família Src
da tirosina cinase, exerce papel na resposta
imune inata e na sinalização para ativação do
STAT 5. ? PTPRC (CD45R) pertence à família dos
receptores da tirosina fosfatase, que desempenha
papel na sinalização dos receptores dos
linfócitos B e T. ? LYZS tem função
bacteriolítica, em tecidos e fluidos corporais.
? PTPN18 fosforilação de aminoácidos.
Desfosforila a autofosforilada tirosina cinase.
115
Papel da colestase lesão histológica hepática
Ácidos biliares hidrofóbicos
Apoptose primária de hepatócitos
PALMEIRA, C. M. ROLO, A. P. Mitochondrially-medi
ated toxicity of bile acids. Toxicology 203,
1-15 (2004).
116
Avaliação do comitê de ética médica
Institutional Animal Care and Use Committee of
Cincinnati Childrens Hospital Research
Foundation.
117
Transporte
Dia 3
118
Ativados
Transportadores de membrana (ATP8A1 e
LAPTM4A) Transportadores nucleares (XPO7 e
NUTF2) Metabolismo (STARD4) Imunidade
(TAP2) Transporte de ânions (SLC4A2) Transporte
de cátions (ATP6V1B2)
Desativados
Transporte de colesterol (APOB) Transporte de
aminoácidos (SLC1A4)
119
Controle da transcrição e da tradução
Dia 14
120
Desativados

• Fatores de transcrição TCF21, MEIS1, PBX1, ZF,
  CEBPG, ZBTB20, JUN
• ? Splicing do RNA SFRS7
• ? Tradução e síntese protéica EIF4A2, SERPINH1

121

Extração RNA das vias biliares
Homogeneização e lise celular (TRIzol)
Fase da separação (fenol/clorofórmio)
RNA
Lipídeos Carboidratos Proteínas
Precipitação (isopropanol)
RNA
RNA
TRIzol Reagent Invitrogen Corporation Life
Technologies, NY, USA
122
Obtenção do cDNA de fita dupla
2,5 µg de RNA Tampão DNase I Água
Destruição do DNA
Temperatura ambiente (15 min)
EDTA 25mM 65C (10 min)
Desativa a DNase
Primers Nucleotídeos Mistura anelamento RNase
OUTTM
Anelamento Desfaz estruturas secundárias RNA
70C (10 min) - 4C (1 min)
SuperScriptTM (transcriptase reversa) Tampão Agent
es redutores
42C (50 min) - 17C (15 min) - 4C (1 min)
Formação do cDNA Destruição do RNA
SupserScriptTM Reverse Transcriptase (Invitrogen
Corporation Life Technologies, NY, USA)
123
RT PCR Curva padrão
? Amostra padrão (conhecida) Coeficiente de
correlação 1.000 ? Amostra em estudo
(concentração desconhecida)
124
RT PCR Curva de dissociação
125
Controle da quantidade e da qualidade do RNA
Beckman DU 64 Spectophotometer Concentraçã
o do RNA (A260 x 4) gt 2,5 µg
Beckman DU 64 Spectophotometer Pureza
(260/280 nm) razão gt 1,6
Agilent 2100 Bioanalyzer Qualidade do
RNA
126
Enzima
Dia 3
127
Processos imunes
OAS1G e OASL2 Enzima 2-5 oligoadenilato
sintetase marcador da atividade dos
interferons Degradação do RNA viral
Expressão gênica
Transcrição ATF5 HRMT1L2
(transcrição do STAT1) Chaperona PDIA3 Ciclo da
ubiquitina USP1 e USP7
Metabolismo
Carboidratos (glicogênio) PYGB Lipídios LIP1
128
Enzima
Dia 7
129
Receptores do interferon I e ativação da via GAS
HCK
Membro da família Src Ativação do STAT5
130
Enzima
Dia 14
131
Ativado GSTA2
Demonstrado previamente em análise de expressão
de genes em fígado de camundongos adultos
submetidos à obstrução crônica dos ductos
biliares extra-hepáticos. CAMPBELL, K. M. et al.
Transcriptional reprogramming in murine liver
defines the physiologic consequences of biliary
obstruction. J. Hepatol. 40, 14-23 (2004).
Resposta da colestase crônica ou do estresse
oxidativo persistente em estágios avançados da
obstrução ao fluxo biliar.
132
Proteínas estruturais
133
Desativados
VIL2 (dia 3)
SVIL (dia 14)
Proteína do citoesqueleto, necessária para a
manutenção e a integridade das microvilosidades
do bordo estriado das células epiteliais
canaliculares, nas quais os transportadores de
membrana da secreção biliar estão localizados.
Expressão diminuída ou ausente do gene VIL nas
crianças portadoras de doenças hepáticas
colestáticas progressivas. PHILLIPS, M. J. et
al. Abnormalities in villin gene expression and
canalicular microvillus structure in progressive
cholestatic liver disease of childhood. Lancet
362, 1112-1119 (2003).
134
Transdução de sinais
Dia 14
135
Receptores do interferon I e ativação da via GAS

STAT5
136
Transdução de sinais
Dia 7
137
STAT1 sinalização do interferons ARHGDIB
sinalização mediada pela proteína Rho, crucial
para a ativação da LFA1 CSF2Rß1 estimula a
produção de leucócitos CEBPß ativa a
transcrição de genes da fase aguda e participa
nos mecanismos que controlam a transcrição dos
genes induzidos pelo interferon
Vias moleculares relacionadas à imunidade
138
Controle da transcrição e da tradução
Dia 3
139
Ativados
Replicação e no reparo do DNA RBBP4, MCM3,
RAD23B, TDG Controle do ciclo celular
NDN Expressão gênica ? Controle transcricional
FUS, ATF4, ATF5, MEF2A, DHX9, TBX2, MTA2, NDN,
TCERG1, PFTF1, SMARCE1. ? Controle
pós-transcricional - splicing do RNA RNPC2
- tradução PUM2, NOL5, EIF4EBP2, EIF4A1 -
ubiquinização de proteínas TRIM30,
MKRN1. Processos imunes ? HRMT1L2 controla a
transcrição do STAT1 ? IRF7e IRF-9 fator
regulador de interferons ? BACH2 controla a
transcrição da AP-1 em células neurais e
linfócitos
140
Desativados fenômenos epigenéticos
Desativação das histonas (HIST1H1E, HIST2H2BE,
HIST1H3A) Metilação do DNA (DNMT3A, CTCF).
O papel dos fatores epigenéticos na patogênese da
atresia pacientes portadores da forma
embrionária. Estrutura da cromatina SMARCA-1,
HDAC3 e RYBP ZHANG, D. Y. et al. Coordinate
expression of regulatory genes differentiates
embryonic and perinatal forms of biliary atresia.
Hepatology 39, 954-962 (2004).