Introduction sur PCR, Clonage et Sйquenзage

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Introduction sur PCR, Clonage et Séquençage

• Sébastien Tempel
• UMR EcoBio 6553, Symbiose Irisa

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• Rappels
• Historique de la biologie moléculaire.
• Notion de biologie.
• La PCR
• Ses buts, sa technique.
• Les méthodes de Clonage
• Les vecteurs de clonage.
• Exemple dun BAC.
• Le séquençage
• Nucléotidique méthode de Sanger.
• Protéique méthode Edman.
• Conclusion

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• Rappels
• Historique de la biologie moléculaire.
• Notion de biologie.
• La PCR
• Ses buts, sa technique.
• Les méthodes de Clonage
• Les vecteurs de clonage.
• Exemple dun BAC.
• Le séquençage
• Nucléotidique méthode de Sanger.
• Protéique méthode Edman.
• Conclusion

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Rappels historiques

• 1869 - F. Miescher substance dans les noyaux
  lADN.
• 1896 - G. Mendel lois de lhérédité.
• 1910 - T. Morgan chromosomes portent les gènes
• 1930 - W. Astbury structure filamenteuse de
  lADN.
• 1944 - O. Avery lien entre lhérédité et lADN
• 1953 - J. Watson et F. Crick double hélice de
  lADN.
• 1955 - F. Sanger séquençage de linsuline
• 1962 - J. Monod et F. Jacob ARNm intermédiaire
  ADN-protéine

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Rappels historiques

• 1968 - M. Nirenberg, G. Khorana et R. Holley
  code génétique
• 1970 M. Temin, D. Baltimore identification de
  la reverse transcriptase.
• 1975 - E.M. Southern Méthode de séquençage des
  nucléotides
• 1978 - W. Arber, D. Nathans, H. Smith
  Identification des endonucléases.
• 1978 Premier génome séquencé (virus SV40 de
  5kb).
• 1983 - K. Mullis invention de la PCR.
• 1995 Premier procaryote séquencé Haemophilus
  influenzae.
• 15 avril 2003 Séquençage génome humain terminé.

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• Rappels
• Historique de la biologie moléculaire.
• Notion de biologie.
• La PCR
• Ses buts, sa technique.
• Les méthodes de Clonage
• Les vecteurs de clonage.
• Exemple dun BAC.
• Le séquençage
• Nucléotidique méthode de Sanger.
• Protéique méthode Edman.
• Conclusion

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Notion de biologievirus, cellules, organelles
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Notion de biologievirus, cellules, organelles
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Notion de biologievirus, cellules, organelles
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Notion de biologievirus, cellules, organelles
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Notion de biologievirus, cellules, organelles
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Notion de biologieADN et ARN

• ADN Acide DésoxyriboNucléique
• Rôle de lADN pérenniser de génération en
  génération les informations de lorganisme.
• Localisation de lADN
• Virus à ADN intérieur de la capside
• Procaryote chromosome circulaire, plasmide
• Eucaryote
• Cellule végétale chromosome, mitochondrie,
  chloroplaste
• Cellule animale chromosome, mitochondrie

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Notion de biologieADN et ARN
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Notion de biologie ADN et ARN
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Notion de biologieADN et ARN

• ARN Acide RiboNucléique
• Rôles de lARN même que celui de lADN dans les
  virus à ARN, intermédiaire entre linformation
  portée par lADN et son expression par les
  protéines
• Localisation de lARN
• ARNm présent partout dans les cellules eucaryotes
  et procaryotes.
• ARNr et ARNt présents dans les organelles où est
  localisé lADN.

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Notion de biologieADN et ARN
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Notion de biologieAcide Aminé
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Notion de biologie Protéine

• Structure primaire séquence dacide aminé.
• Structure secondaire hélice alpha, feuillet
  bêta, pont disulfure.
• Structure tertiaire suite de structure primaire
  et secondaire.
• Structure quaternaire association de structure
  tertiaire
• Ex tétramère dhémoglobine, insuline...

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Notion de biologieProtéine
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Notion de biologie Protéine
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Notion de biologie Protéine
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Notion de biologie Protéine
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Notion de biologie
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• Rappels
• Historique de la biologie moléculaire.
• Notion de biologie.
• La PCR
• Ses buts, sa technique.
• Les méthodes de Clonage
• Les vecteurs de clonage.
• Exemple dun BAC.
• Le séquençage
• Nucléotidique méthode de Sanger.
• Protéique méthode Edman.
• Conclusion

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PCRPolymerase Chain Reaction

• But de la PCR
• Amplification dADN.
• Base pour différentes techniques de biologie
  moléculaire
• Séquençage
• Amplification de lADN pour le clonage
• mutation ponctuelle
•  differential display 
• préparation dADNc  RT-PCR 
• détermination de polymorphisme entre génomes
  (RFLP)
• .

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(No Transcript)
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• Rappels
• Historique de la biologie moléculaire.
• Notion de biologie.
• La PCR
• Ses buts, sa technique.
• Les méthodes de Clonage
• Les vecteurs de clonage.
• Exemple dun BAC.
• Le séquençage
• Nucléotidique méthode de Sanger.
• Protéique méthode Edman.
• Conclusion

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Clonage de séquences

• Vecteur de clonage
• Plasmide bactérien ( 3-4 kb )
• Phage ? ( 9-22 kb )
• Cosmide ( 45 kb )
• PAC P1-derived Artificial Chromosome ( 75-95 kb
  )
• BAC Bacterial Artificial Chromosome ( 100-350
  kb )
• YAC Yeast Artificial Chromosome ( 300-500 kb )

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• Rappels
• Historique de la biologie moléculaire.
• Notion de biologie.
• La PCR
• Ses buts, sa technique.
• Les méthodes de Clonage
• Les vecteurs de clonage.
• Exemple dun BAC.
• Le séquençage
• Nucléotidique méthode de Sanger.
• Protéique méthode Edman.
• Conclusion

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Clonage de séquences

• Structure du BAC
• oriS origine de réplication
• repE maintient du nombre de plasmide à 1 ou 2
  par cellule.
• parA, parB stabilité du plasmide,
  incompatibilité avec les autres facteurs F.
• CMR gène de résistance au chloramphénicol.

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Clonage de séquences

• Structure du BAC
• Site de clonage dans le gène LacZ.
• T7 et SP6 promoteurs forts de bactériophage.
• NotI, HindIII, BamHI site de reconnaissance des
  endonucléases.

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Clonage de séquences

• Digestion du vecteur et de lADN à cloner par
  HindIII.
• Sélection de lADN gt150kb par électrophorèse.

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Clonage de séquences

• Transformation de E.coli par électroporation
• Les bactéries à transformer doivent être en phase
  exponentielle de croissance.
• Le courant traverse les membranes des E.coli
  formant des pores sur les membranes.
• Les macromolécules chargées (comme les vecteurs)
  pénètrent par les pores des bactéries.
• Lintensité et la durée du champ électrique
  doivent être précises
• Si trop faible les pores seront trop petits pour
  laisser entrer les vecteurs.
• Si trop fort, les pores ne pourront pas se
  refermer tuant ainsi la cellule.

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Clonage de séquences

• Étalement des colonies sur un milieu contenant du
  chloramphénicol, de IPTG et de lX-Gal.
• IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside) sucre
  induisant la transcription du gène LacZ.
• X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactosid
  e) sucre donnant une coloration bleue sil est
  utilisé (dégradé) par LacZ.
• Bactérie avec le plasmide (BAC) donnera des
  colonies
• Couleur bleue si le plasmide ne contient pas
  dADN recombinant.
• Couleur blanche si le plasmide en contient.

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Clonage de séquences
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Clonage de séquences
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• Rappels
• Historique de la biologie moléculaire.
• Notion de biologie.
• La PCR
• Ses buts, sa technique.
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• Les vecteurs de clonage.
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• Le séquençage
• Nucléotidique méthode de Sanger.
• Protéique méthode Edman.
• Conclusion

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Séquençagenucléotide méthode de Sanger

• ddNTP analogues structuraux des dNTP.
• ddNTP incapables de réaliser une liaison
  phosphodiester.
• ADN polymérase incorpore dNTP ou ddNTP.

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Séquençagenucléotide méthode de Sanger
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Séquençagenucléotide méthode de Sanger

• Liaison de lamorce avec lADN à séquencer.
• La fixation des ddNTP aux brins dADN va créer
  des brins de différentes tailles.
• Les brins vont migrer sur un gel délectrophorèse
  selon leur taille le plus petit migre le plus
  vite.

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Séquençagenucléotide méthode de Sanger
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Séquençagenucléotide méthode de Sanger

• Automatisation de la méthode
• Ajout sur les ddNTP de fluorochrome de
  différentes couleurs.
• 1 seul tube regroupant les ddNTP.
• Lecture par un laser des fragments qui migrent
  sur le gel.
• Stockage des données dans la mémoire de
  lordinateur.

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Séquençagenucléotide méthode de Sanger
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Séquençagenucléotide méthode de Sanger
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• Rappels
• Historique de la biologie moléculaire.
• Notion de biologie.
• La PCR
• Ses buts, sa technique.
• Les méthodes de Clonage
• Les vecteurs de clonage.
• Exemple dun BAC.
• Le séquençage
• Nucléotidique méthode de Sanger.
• Protéique méthode Edman.
• Conclusion

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Séquençageprotéique

• Si on possède lARNm
• Réalisation dune RT-PCR (Reverse Transcriptase
  PCR)
• Transformation de lARNm en ADNc par la reverse
  transcriptase.
• PCR classique sur lADNc.
• Séquençage des nucléotides amplifiés par méthode
  de Sanger
• Si on ne possède que la protéine
• Purification de la protéine par méthode de
  chromatographie
• Méthode dEdman.

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Séquençageprotéique méthode dEdman
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• Notion de biologie.
• La PCR
• Ses buts, sa technique
• Les méthodes de Clonage
• Les vecteurs de clonage.
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• Le séquençage
• Nucléotidique méthode de Sanger.
• Protéique méthode Edman.
• Conclusion

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Conclusion