A rekombinбns DNS technolуgia йs alkalmazбsai

1
A rekombináns DNS technológia és alkalmazásai
DNS darab izolálása
A DNS vizsgálata, célzott módosítása
A módosított DNS visszajuttatása a genomba.
Fenotípus változás vizsgálata
2
A rekombináns (kiméra) géntechnológia alapelve
genomi DNS
vektor
rekombináns DNS
klónozott DNS
3
A baktérium plazmidok a leggyakoribb vektorok
fractionation
A plazmidok jól tisztíthatók a baktériumokból, és
módosítás után transzformációval
visszajuttathatók egy másik baktérium sejtbe. Ma
a plazmidokat már egylépéses affinitás
kromatográfiával tisztítják.
4
A restrikciós endonukleázokmuködése
(EcoRIE. coli Restrikciós enzim I)
A restrikciós enzimek szekvencia specifikus,
palindróm szekvenciát felismero DNS hasító
enzimek.
A rekombináns DNS technológia megjelenését a
tisztított vektoroknak és a tisztított genomi
DNS-nek a restrikciós enzimekkel történo hasítása
és módosítása tette lehetové.
5
Plazmid vektorban készült rekombináns (kiméra) DNS
6
A rekombináns DNS sokszorozása baktériumokban
7
A génkönyvtár
A rekombináns plazmidok mindegyike más-más
genimikus DNS darabot tartalmaz. A baktériumba
való transzformáció során minden baktérium csak
egyetlen plazmidot vesz fel. A baktériumok
összessége azonban az egész genomot tartalmazza,
ezt nevezik génkönyvtárnak. A baktériumokat úgy
szélesztik ki, hogy mindegyikük különálló
kolóniát hozzon létre. Egy kolónia tehát csak
egyféle plazmidot, vagyis egyféle genomi DNS
darabot tartalmaz. Ez a kolónia klón.   Ahhoz,
hogy egyetlen genomikus gént izolálni tudjunk az
egész génkönyvtárat fel kell szaporítani, és a
kívánatos szekvenciát hordozó baktérium kolóniát
azonosítani kell.
8
Idegen DNS-t (inszertet) tartalmazó klónok
szelekciója
A ligálás során antibiotikum rezisztenca gént,
vagy muködoképes enzim gént szakít meg a
beinszertálódó DNS darab, ami szelekciót tesz
lehetové. Így az inszertet hordozó baktériumok
szelektálhatók. Maximális inszert méret
plazmidoknál 25 kb
9
A l fág vektorként való alkalmazása
Inszert méret 15 kb.
Csak az inszertet tartalmazó fág DNS mérete
alkalmas a fágfejbe pakolódáshoz (szelekció). A
fágfertozés nagyságrendekkel hatékonyabb a
transzformációnál.
10
Fág- és plazmid vektorok tulajdonságainak
egyesítése Kozmid vektorok
Inszert méret 45 kb. A cos vég a fágfejbe
pakolódáshoz kell, segítségével megmarad a
fágvektorok nagyon hatékony inszert szelekciója
és bejuttatási módja fágfertozéssel.
A baktériumba fágfertozéssel bejutó kozmid
plazmidként viselkedik, és plazmidként
tisztítható.
11
Kívánt gén klónjának azonosítása génkönyvtárból
12
Genomikus génkönyvtár készítése fágban
A könyvtárból kiszélesztendo klónok száma
Genom méret inszert méret
x 10
A génkönyvtár a teljes genom minden darabját több
példányban tartalmazza.
13
Kívánt klón azonosítása radioaktív próbával
Ha a keresett klón DNS darabja rendelkezésre áll,
akkor a könyvtárban a jelölt DNS darab
hibridizációjával azonosítható. Honnan származhat
a DNS darab? A génterméket (mRNS-t)
nagymértékben kifejezo szövetbol. A próba lehet
a fehérje szekvenciája alapján készített DNS
oligonukleotid. Más fajból már ismert homológ
DNS darab, stb. Expressziós könyvtár esetén a
fehérje elleni antitest.
14
A cDNS ( copy vagy másolati DNS) eloállítása
A cDNS nem tartalmaz intronokat és
regulátor szekvenciákat, így róla a baktérium is
tud fehérjét készíteni. A cDNS könyvtárban egy
szövet összes érett mRNS-e megtalálható.
Az ovalbumin gént ovárium cDNS könyvtárból
klónozták, mivel abban az adott mRNS feldúsul.
15
Gén klónozása antitest felhasználásával
A cDNS kifejeztetésére expressziós vektort
használnak, amely fúziós fehérjét termel.
in vitro packaging, plate on bacterial lawn
Tisztított fehérje megléte esetén a kódoló gén
azonosítására használható módszer az expressziós
könyvtár.
pick positive clones from master plate
16
Oligonukleotid próba tervezése aminosav sorrend
alapján
48 féle oligó A fehérjét kódoló összes
lehetséges szekvenciát tartalmazza.
17
A Neurospora crassa trp3 génjének klónozása
komplementációval (mutáns menekítésével)
A trp3 auxotrófokat a vad típusból származó
teljes génkönyvtár egy több klónt tartalmazó
alcsoportjával transzformálják, majd minimál
táptalajra szélesztik. A növekedés arra utal,
hogy a keresett gén benne volt az alcsoportban,
bejutott egy auxotrófba, és menekítette a mutáns
fenotípust. Ezután a menekíto klónok csoportját
újabb alcsoportokra osztják, majd megismétlik a
folyamatot. Egészen addig, míg megkapják a
mutációt menekíto vad típusú gén egyetlen
klónját.
18
A menekíto DNS Neurospora kromoszómába való
beépülésének 3 változata lehetséges
A menekítés csakis beépüléssel történhet, ami
háromféleképpen is megvalósulhat.
A coli plazmidja nem replikálódik gombában.
2.,
1.,
3.,
19
A kromoszóma menti séta, pozícionális klónozás
A korábbról klónozott A szakaszból klónozások
sorozatával eljuthatunk az e szakaszig úgy, hogy
minden lépésben a könyvtárból azonosított klón
túlsó végével újabb klónokat azonosítunk.
Korábban klónozott génhez közel térképezodo másik
gén klónozható ilyen módon.
20
Inszerciós mutagenezis kiaknázása gén klónozásra
A transzpozonok kiváló inszerciós mutagének. Az
inszerciós mutánsból génkönyvtár készül, és a
transzpozon mint molekuláris marker, DNS
próbaként használható a gén azonosítására.
21
A klónozott gén vizsgálata
22
A Southern hibridizálás
Ez a módszer DNS keverékbol azonosít egy adott
DNS szakaszt. Klónozott DNS (gén) jelenléte
vizsgálható így más törzsekben vagy fajokban. A
gél minden sávjában más-más törzs vagy faj
emésztett DNS-e fut. Ezzel kimutatható a gén
méret, vagy szerkezetbeli megváltozása is.
festett gél autoradiogram
23
A Southern, Northern és Western technikák
Elektroforézissel a DNS, RNS vagy fehérje
molekulák méret szerint elválaszthatók. A
gélben elválasztott molekulák filterre
blottolhatók. A filteren hibridizációval
azonosíthatók a próbával homológ fragmentek,
ellenanyag festéssel pedig a kérdéses
fehérje. Southern-nel a gén DNS-e, Northern-nel
a gén RNS-szinten történo kifejezodése,
Western-nel a fehérje kifejezodése vizsgálható.
24
Restrikciós térképezés
A térkép egy adott DNS szkasz ismertetoje,
azonosítója. Pl. megszekvenált különálló DNS
darabok restrikciós mintázat alapján
összeilleszthetok, vagy a mintázat alapján
homológ kromoszóma szakaszok azonosíthatók. A
módszer teljes genomi DNS-bol is muködik.
Ilyenkor a genomikus DNS emésztése után a
fragmentek Southern hibridizációval tehetok
láthatóvá.
25
A Sanger-Coulson-féle lánc terminációs DNS
szekvenálás
dideoxy nukleotid trifoszfát(ddNTP)
4 különbözo fluorescens festékkel jelzett
primer esetén a 4 reakció egyetlen zsebben
futtatható.
26
A Sanger-Coulson-féle lánc terminációs DNS
szekvenálás
A szekvenálandó DNS szakasz elé kötodo rövid
primert készítenek, és az 5 végét megjelölik
(radioaktívan, vagy festékkel). A denaturált
szekvenálandó DNS darabot, és a jelölt primert
összekeverik egy DNS polimerázt és a 4 dNTP-t,
valamint az egyik ddNTP-bol kis mennyiséget
tartalmazó reakcióban. 4 külön reakció készül,
mindegyik más-más ddNTP-t tartalmaz. A polimeráz
a primer folytatásaként átírja a DNS templátot,
miközben véletlenszeruen ddNTP-t is beépíthet a
láncba. Ez azonnal megszakítja az adott lánc
szintézisét. A ddNTP kis koncentrációja miatt
bárhol beépülhet a láncba, de mindig csak a neki
megfelelo dNTP helyére. Mivel sok molekula
szintézise folyik párhuzamosan egyik hamarabb,
másik késobb szakad meg. Mindegyik molekula a
primerbol származó színes vagy radioaktív jelet
hordoz a végén. A különbözo hosszúságú szintézis
termékek gélelektroforézissel elválaszthatók. A 4
reakciót egymás mellett futtatva leolvasható,
hogy melyik molekula melyik nukleotidnál
végzodött. Adott sávban mindig ugyanazon
nuleotidnál végzodo molekulák futnak. A négy sáv
összeillesztésével leolvasható a teljes nukleotid
sorrend.
27
A fehérje kódoló szakasz azonosítása a szekvencián
Egy DNS szekvencia 6 -féleképpen olvasható, mert
mindkét szálnak 3 olvasata van ahol mindegyik
olvasat egy nukleotiddal elcsúszva kezdodik.
Minden olvasási keretben az ATG start kódonokat
követo elso stop kódonig (TAA, TAG, TGA) tart a
leolvasás. A hosszú leolvasási keret (ORF) gént
valószínusít.
28
A polimeráz lánc reakció (PCR) sematikus
ábrázolása
A DNS szálak 2 hatványai szerint szaporodnak. A
Taq DNS polimeráz kibírja a 95 oC denaturálást,
így nem kell minden kör után új enzimet adni a
reakcióhoz.
29
A géntechnológia alkalmazásai
30
Az alkaptonuria betegség (AKU) okainak
felderítése
31
A modern genetikai analízis lépései az
alkaptonuria betegség példáján
1., A betegség fenotipikus azonosítása, (levegon
feketedo vizelet). 2., Családfa analízis
bizonyítja az örökletes hátteret és az
öröklésmenetet. 3., Biokémiai analízis bizonyítja
az enzimhibát és a mutáns enzim kilétét. 4.,
Klasszikus genetikai térképezés és hibridóma sejt
térképezés a mutációt a 3. kromoszómára
térképezi. 5., A HGO gént modell szervezetben
auxotrófia alapján azonosítják, és
klónozzák. 6., Az Aspergillus gén humán
génkönyvtárból azonosítja a homológ cDNS-t. 7.,
Northern blot alapján a gén a májban fejezodik
ki. 8., A klónozott humán cDNS genomi
könyvtárból azonosítja a kódoló szakaszt. 9., A
kódoló szakasz in situ hibridizálással
megerosíti, és pontosítja a kromoszómális
helyzetet. 10., Betegekbol PCR-el megklónozott
allélok szekvencia összehasonlításával
kiderülnek a mutációt okozó báziscserék. 11., A
mutáns pontok PCR-es azonosításával pontosan
követhetové válik a hibás allélek
öröklodése. A humán gén jellemzését öröklodési
mintázata, evolúciós konzerváltsága,
kromoszómális helyzetének ismerete, és a
felhasznált molekuláris módszerek sokasága tette
lehetové.
32
Gyógyítás géntechnológiával. A humán növekedési
hormon (hGH) termelése baktériumban
added
33
Humán fehérje (hGH) termelése baktériumban
Az emberi növekedési hormont (hGH) az inzulin
után elsok között temelték rekombináns DNS
technológia segítségével baktériumokban. A
hormont az örökletes törpeség gyógyítására
használják. 1., A hormon génjérol két lépésben
eltávolították a sejtbol való kijutáshoz
szükséges szignálszekvenciát. 2., Bakteriális
expressziós vektorba juttatták, ahol bakteriális
promóter muködteti a gént. 3., A baktériumban
indukálták a transzgén kifejezodését. 4.,
Feltárták a baktérium sejteket és kitisztították
a fehérjét. 5., Mivel a fenti módon nehezen
tisztítható metioninnal kezdodo fehérjét
kaptak. Úgy módosították a módszert, hogy
baktérium szignálszekvenciával látták el a humán
gént. Ilymódon a fehérje pontosan megegyezik a
humán fehérjével, és kiválasztódik a sejtbol és
könnyen tisztítható.
34
szentjánosbogár luciferázt termelo dohány
A klónozott gén megváltoztatása, és
visszajuttatása a genomba, transzgénikus
élolények létrehozása,
reverz genetika.
35
Reverz genetika mutáns képzése homológ
rekombináció segítségével
klasszikus genetika mutáns fenotípus mutáns
allél DNS szekvencia fehérje szekvencia
reverz genetika fehérje szekvencia DNS
szekvencia mutáns allél mutáns fenotípus
36
A klónozott gén célzott megváltoztatása
oligonukleotidokkal
37
Eukariótáknál a DNS sejtbe juttatására több
módszer létezik
wolfram puska, mikroinjektálás, vírus vektor
használata, transzformálás
A bejutott DNS leggyakrabban homológ
rekombinációval épül be a kromoszómába, de
gyakori a véletlen beépülés is.
38
Gén bejuttatás élesztobe, éleszto vektorok
Baktérium plazmid beépülése éleszto kromoszómába
egyszeres vagy kétszeres crossoverrel.
Felhasználás Éleszto genetika, Fehérjetermelés,
YAC klónozó vektor
1000kb
39
Éleszto vektorok
Az élesztonek nem csupán jól jellemzett genetikai
rendszere van, hanem klónozott gének élesztobe
juttatásához négyféle vektor is használható. a.,
Egyszeru baktérium plazmid éleszto szekvenciával.
Ez 1 vagy 2 rekombinációval épülhet be az éleszto
kromoszómába. b., Az éleszto saját plazmidja
coli plazmiddal kombinálva shuttle ( inga vagy
kettos) vektort ad. Ez azonban el is veszhet az
éleszto osztódások során. c., Az éleszto
centromert plazmidba építve stabilan öröklodo,
kromoszómaként viselkedo vektor -éleszto plazmid-
nyerheto. d., A centromert tartalmazó lineáris
DNS darab végeire éleszto telomer szekvenciát
helyezve több mint 1000 kb idegen DNS-t befogadó
YAC vektort kapunk. Ezen vektorok segítségével az
éleszto ugyanúgy használható fehérje termelésre
vagy génkönyvtár készítésére mint az E. coli
baktérium.
40
Gén bejuttatás növényekbeA növényi tumort okozó
A. tumefaciens és Ti plazmidja
A baktérium fertozés után a plazmid T-DNS
szakasza bejut a növénybe, ahol a kromoszómába
épülve tumor képzodést vált ki.
41
Az Agrobaktérium vektor elokészítése
Agrobaktériumba transzformálás
A disarmed vektort tartalmazó Agrobaktérium
törzset a bevinni szándé-kozott gént hordozó
intermediate vektorral is transzformálják. A
két vektor rekombinációval egyesül és a baktérium
csak ezután képes a fertozött növényi sejteket
transzformálni.
klónozó plazmid vektor
spectinomycin selection
Növényi sejt fertozése
42
Az A. tumefaciens és Ti plazmidja
A talajban élo Agrobaktérium egy Ti nevu
plazmidot tartalmaz, és növényi tumorképzodést
okoz. A Tumor úgy jön létre, hogy a baktérium a
növénybe juttatja a plazmid DNS egy részét a
T-DNS-t, amely stabilan beépül a genomba. A
beépülést a plazmid T-DNS-en kívüli génjei által
kódolt fehérjék irányítják. A T-DNS is több
fehérjét kódol. Ezek egy része a tumorképzésért
felel, míg más része olyan fehérjéket kódol,
melyek egy szerves vegyület, az opin szintézisét
végzik a növényben. Az opint az Agrobaktérium
használja N2 forrásként. A Ti plazmid
természetes növényi vektor. Azonban túl nagy és
nem kisebbítheto könnyen, mert a beépülés fontos
génjeit kódolja. Módosított változatában kiejtik
a tumorképzodésért felelos géneket, és csak a
T-DNS bal végét hagyják meg, majd visszajuttatják
Agrobaktériumba. Egy másik kisméretu klónozó
vektorba (intermediate) építik be a bevinni
szándékozott idegen gént. Ez a vektor szintén nem
tartalmazza a tumor géneket, viszont benne van a
beépüléshez szükséges jobb vég, valamint
szelektálható antibiotikum rezisztencia, gének és
klónozóhely (coliban is növesztheto). Az idegen
DNS bevitele után az intermedier vektort olyan
Agrobaktériumba transzformálják amely a
csonkított egész vektort tartalmazza. Itt
rekombinációval egy kointegrált vektor jön létre,
amely a beépüléshez szükséges mindkét széli
szekvenciát tartalmazza. Ennek a létrejötte
spektinomicin szelekcióval ellenorizheto. Az
intermedier vektor önmagában nem stabil a
baktériumban. Ezzel a baktériummal növényt
fertozve az idegen gén a növénybe viheto.
43
Transzgénes növény eloállítása és öröklésmenete
Az agrobaktériummal növényi szövetdarabot
fertoznek táptalajon, majd növényt nevelnek
belole.
kanamycin selection
44
Génbevitel állatokba
A juhba bejuttatott humán gént emloben aktív
promóter vezérli, így a fehérje a transzgénikus
utód tejébol tisztítható.
45
Növekedési hormon hiányos törpe egér
génterápiája patkány növekedési hormon (RGH)
bevitelével
A kromoszómába beépült transzgén kifejezodése
nehézfémmel indukálható.
A transzgén domináns öröklésmenetet mutat.
46
Az RGH növekedési hormont transzgénrol kifejezo
egér és lazac nagyobbra no normális fajtársainál
47
A génterápia lehetséges módjai
Embernél csak a szomatikus génterápia jöhet
szóba, ami csak néhány szövetben használható.
Ennek során a beteg szövetbol nyert osztódó
sejtekbe (pl csontvelo) juttatják a transzgént.
A kezelt sejtek visszajuttatásával mozaikos
szövet hozható létre.
48
Mesterséges emberi kromoszóma Egy lehetséges
humán transzgén vektor.
49
Genetikai betegségek elorejelzésePrenatalis
diagnosztika (amniocentezis)
50
Restrikciós fragment polimorfizmus (RFLP)
térképezés
Az RFLP egy olyan fenotípusnak tekintheto,
amelyet laboratóriumi módszerrel észlelünk. Az
RFLP lókuszok rekombinációs kromoszóma
térképezéshez jól felhasználhatók. D domináns
betegség lókusza egy RFLP lókusszal szorosan
kapcsolt, ezért az RFLP adat diagnózis értéku is
lehet.
51
A génkifejezodés szabályozása riporter génekkel
vizsgálható transzgénikus élolényekben
A genomba juttatott riporter gén kifejezodése
(pl. b-galaktozidáz, GFP) a melléje helyezett
szabályozó szekvenciáktól függ. A szabályozó
szekvencia darabolásával megközelíthetok a
génszabályozás elemei.