High Performance Liquid Chromatography

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High PerformanceLiquid Chromatography
2
Contents

• Introduction.
• Classification of Chromatography.
• Theory
• LC System
• Troubleshooting.

3
Chromatography

• ??. - ??? ??? ??? ??, ? ??? ??? ??? ??? ???? ?
  ??? ???? ??. - ????? ? ??? ???? ??? ???
  ??, ??, ????, ?? ? ????? ??.
• ??. - 1903? ??? ???? Tsweltt? ??? ???? ???
  ???(?? ??)? ?? ??? ?????? ???? ???? ?? ???
  (??? ?? ?????)? ?? ?? ??? ??????? ??? ??. -
  ??? ?? ??? 1941? Martin? Synge? ?? ??? ??? ???
  ??? ??? ???? ???? ???? ????? ??? ??-??
  ???????(LLC)??. - ???? High performance liquid
  chromatography(HPLC)? ?? ?? ?? ??? ?? ????
  ???? ?? ?? ??? ??? ?? ??.

4
Classification of Chromatography

• ???? ??? ?? ?? ? ? ???, ???? gas? ???? Gas
  chromatography(GC)??, liquid? ???? Liquid
  chromatography(LC) ??, gas? liquid? ??? ??? ??
  ??? ???? Superitical fluid chromatography?
  ??.
• GC? ???? ???? ??? ?? ???? ??? ??? ???? ? ?-??
  ????? ????? ??? ??? GSC? ???? ?? ?? ?(Solid
  support)? ?? ??? ??? ??? ????? ???? ?? ? ??
  ??? ?? ???? ??? ??? ??? ???? GLC? ??.

5
Chromatography
Supercritical Fluid Chromatography
Gas Chromatography
Liquid Chromatography
Gas-solid
Gas-liquid
Ion exchange
Size exclusion
Adsorption
Partition
Affinity
Gel Filtration
Gel permeation

6
Adsorption Chromatography

• ??. - ?? ??? chromatography ???, ???? ??? ????
  ?? ???? ??? ???? ???? ??? ?? ??. - ????
  ??? ?? ?(column)? ????, ?????? ????? ????
  ??? ??? ????. ???? ??? ??? ??? ?? ?????
  ????? ???? ???? ?? ??? ??? ???? ??? ??. -
  GSC? ?? ???? ??? ??? ????? ???? ?? ??? ???
  ??? ??.
• ???(Adsorbent)? ??. - ????? ???? ???
  ???(SiO2), ????(Al2O3), ???? ?? ?? ???, ? ?
  ????? ????? ???.

7

8
Partition chromatography

• ??. - ?? ?? ???? ??????? ????, ???? ???? ???
  ??? ???? ??? ????, ?? ??? ???? ???? ???
  ??? ????? ???? ?? ?? ??, ??? ??? ???.
• ??(Normal phase). - ???? ???? ???? ?????, ???
  ???? ?? ??. - ????? ???? ??? ???? Nitrile,
  Diol, Amino ?? ?? ?? ?? ????.
• ??(Reverse Phase). - ???? ????? ???? ????,
  ?????? ?? ??. - ???? ???? 8? ?? 18?? ??? ????
  ????.
• ??. - ????? ???? ?? ?? ????? ?? ???? ???? ??
  ??? ??? ???? ???? ??

9

10
Ion-exchange chromatography

• ??. - ??????? ????? ?? ?, ?? ?? ????? ????? ?
  ? ?? ???? ??? ???? ????? ?? ?? ??? ??.
• ???? ??. - ??? ?? ?? P-? ???? X-? ???? ??? R?
  ?? ?? ? ?? ??.
• - ?? ??? ????? ???? ? ?? S-? ?? ??, ???? ??
  ??? ???? ??.
• ?? ???. - ?? ??? polystyrene, polydextrans,
  cellulose, silica ?? ????? ???? ??? ???? ??
  ???? ??.

RX- P- R P- X-
RP- S- R S- P-
11
???? ????? ??? ??? ?? ??????
??? ????

12
Size exclusion chromatography

• ??. - ??? ???? ?? ????? ????, ???? ??? ??? ??
  ??. - ? ??? ?? ???? ?? ?? ?? ?? ??? ? ?? ??
  ?? ?? ??? ?? ?? ? ??? ?? ?? ???? ?? ??.
• ??. - Gel filtration chromatography(GFC)
  ??? ??? ????? ?? ?? ??. - Gel permeation
  chromatography(GPC) ???? ??? ????? ???? ??.
  

13

14
Affinity chromatography

• ??. - ?? ??? ??????, ?? ???? ??. - ???
  ?????? ??? ?? ??? ???? ??? ????? ????
  ????? ?? ??? ????? ???? ??? ??? ?? ????
  ??? ?? ?? ?? ??? ??. - ?? ?? ? ??? ???? ???
  ???? ??? ??? ?, ?? ??? ???? ??? ???? ???
  ????.
• ???? ???. - ??, ????? ???? ??? ??? ?? ???? ???
  ??. - ???? ???? ?, ????, ??? ???? ???? ??.

15

16
Theory

• LC? ????. - ???? ??? ?? ??? ?? ?? ??? ?? ??
  ??, ??? ??? ??? ??? ???? ? ??? ???? ??? ???
  ??? ?? ?????? ????? ???? ???? ?? ????? ???
  ?? ??.
• ????(Partition coefficient). - ? ?? X? ???
  ????? ???(s,???)? ???(m)??? ?? ? ?????, ???
  ?? ??? ?? ??? ?????? ?? ??? ?? ? ?? ??.

Xs ???? ??? ??? ??.Xm ???? ??? ??? ??.K
?? ??.
17
C component
B component
A component

18
tM ???? ??? ?? ???? ??? ??trB ?? B? ??? ??
???? ??? ??twB ?? B ??? ?, h ????

19
Theory

• ????(Capacity factor). - ? ??? ????? ??? ???
  ???? ??? ??? ???? ? ??? ? ? ???? ??? ?? ??.
  - ? ??? ??? ?? ???? Capacity factor k ? ???,
  ????? ???? ??? ? ???, ??? ???.

tM ???? ??? ??trB ?? B? ??? ??
- K 0 ??? ??? ?? ???? ?? tM? ???. K 1
??? tM? 2?? ?? ??? ???. 1lt K lt6 ??? ???? ???.
20
Theory

• ? ?? - ? ???? ???? ?(theorecal plate)? ?????
  ?? ?? ??, ?? ??? ??? ??? ???? ?? ???. -
  ??? ?? ??? ???? ?? ?? ??? ? ???? ????. - ?? ???
  ?? ?? ?? ??? ??, ? ?? ?? ?? ??? ??.
• ?? ??? ????? ??.- ?? ???? ??? ???? ?? ?? ?? ?
  ?? ?? ????? ????, ?? ???? ??? ?? ??? ??? ???
  ??? ?? ? ? ? ?? ????? ??.- ???? ??? ?????,
  ??? ?? ?? ??.- ??? ??? ?? ??.

21
??? L ??? ??, N ????, HETP ? ??
??(the Height equivalent to a theoretical plate).

22
Theory

• ???(Resolution). - ???? ?? ?? ? ???? ???? ???
  ?? ?? ? ? ??. - ??? ????? ???? ????
  Capacity factor, Selectivity, ??? ? ?? ???
  ??, ??? ??? ?? ?? ? ? ??.

- ??? ? ? selectivity, k2? ???? ? ? ?? ? ???
capacity factor ??, kave? ? ??? capacity
factor.
23

24

25
??? gt2000
????? ??
?? ??
??? ??? ??? ??(hexane?? CHCl3)
???? ?????
?? ?? ?? ?? ??? ??(CHCl3?? CH3OH)
???
Bondednormal-phasechromatography
Bondedreverse-phasechromatography
CHCl3? ??
Alcohol, acetonirile , ethyl acetate? ??
Adsorptionchromatography
Bondednormal-phasechromatography
C18, C8, C2,C1, phenyl, cyano
Ion-exchange orion chromatography

26
??? lt 2000
????? ??
?? ??
???? ?? ???
???
????lt 30 nm
????30 nm 400 nm
????lt 30 nm
????30 nm 400 nm
Bondedreverse-phasechromatography
Bondedreverse-phasechromatography
Molecular exclusionchromatography
C18, C8, C4

27
Liquid chromatography

• LC? ??. - ???? ??, ?? ?? ?? ?? ?? ? ??? ??.
  - ??? ??? ??,?? ??? ??. - ????? ??? ??? ?? ?
  ??.
• HPLC ??? ??. - HPLC system? ???(solvent) ?????
  ??????(degasser), ? ?(pump), ??? (column),
  ??????(injector), ???(detector), ?
  ??(recorder)? ?? ???? ??. - HPLC system???
  ???(column? ???)? ??? ??? 10 ? ? ?? ?? ?????
  ???(solvent)? ?? ? ??? ?? ??? ?? ? ??? ??? ???
  ? ?? ??? ??.

28
Mobile phase

• HPLC? ???? ??? ???? ? ??. - ??? ??? ??, ????
  ???? ???? ???. - HPLC grade? ?? ??? ??. -
  ????? ?? ??? ??? ???? ??? ??, ??? ??? ? ?? ??
  ??? ??? ???? ??. - ?? ????, HPLC ???? ??? ? ? ??
  ??? ????? ? ? ?? ?? buffer ??? ????.
• ??? ??(isocratic elution)? ??? ??(gradient
  elution). - ??? ?? ????? ??? ??? ?? ?? ?. -
  ??? ?? ??? ??? ????? ??? ?? ??.

29
Pump

• ??? ???? ? ??. - ???? ??? ?? ??. - ?? ???
  ???? ??? ?? ??? ??? ??. - ??? ??? ???? ??? ?? ?
  ?. - ???? ??? ??, ??? ?? retention time? ?? ?
  ??? ??. - ???? ??? ??? ??? ??? ??? ??.
• Reciprocating ??? ????. - ???? ?? ???? inlet
  ball check valve? ?? ??? ?? ??? ??? ????
  ???? ?? ???? ??? outlet check valve? ? ? ???
  ??? ??? ?? ???.

30

31
Injector

• ?? ?? ??(Injector). - ??? ?? ??? ?? loop? ??
  ??? ?? ??? ??. - Injector? load??? ?? ???? ??
  ?? ??? load?? ??? injector? loop?? ?? ????
  ???? ???? loop? ??? ?? ??? injector? inject???
  ??? ???? loop? ???? ??? ? ? ??? ???? ????.

32

33
Packed materials

• Large porous. - ?? ??? ??? 50 250 ?m ??? ???
  ??? ?? ??. - ??? ??? ??? 0.1 1 atm?? ??, ????
  ??? ?0.1mL / min?? ?? ?? ??? ?? ??. -
  ???? ???? ?? ??? ?? ? ? ?? ??? ?? ??.
• Pellicular. - ?? 40 ?m ??? ???? porous?? ??
  ?? ?? ?? 13 ?m ? ?? ????, ??, ?? ??? ?? ???
  ??? ?? ???. - ???? ??? ?? ?? ?? ??? ??? ?? ???
  ??? ?? ? ? ??? ??? ????, HPLC? ??. - ????
  ???? ?? ??? ? ?? ???? ??.
• Porous microparticle. - 5 10 ?m??? ??? ????,
  ?? ??? ?? ??? ?? ??? ?? ????? ???? ?? ?? ? ?
  ?? ?? ??? ??. - ??? ? ??? ?? ?? ??? ??? ?? ???
  ??? ??.

34

35
Packed material

36
Flow
I.D 100 700 ?m
Stationary phase
Solid support
(a) Wall coated open tube
(b) Support coated open tube
(c) Porous layer open tube

37
Column

• ??? ??(Analytical column). - ??? ?? ??? ??? ??
  25Cm, ?? 4.6mm, ???? ?? 5 ?m, ???? 400, 000
  60, 000 plate/m. - ???? ?? ??? ???? ?? ?? Micro
  LC? ?? ?? 1 4.6 mm, ??? 37.5cm, ???? ???
  35 ?m? ??? ??.
• ????(Guard column). - ??? ??? ???? ??? ?????
  ??? ????, ?? ??? injection system?
  analytical column??? ????. - ???? ?????? ???
  ??? ???? ?? ???? ?? ?? ?? ?? ?? ??, ?????
  ???. - ??? 510cm ??? ??? pellicular ???? ????
  ??.

38
UV-Vis detector

• ??. - ???? ?? ??? ?? ??? ?? ??? ? ?? ??? ????
  ?? ??? ?? ??? ??. - ???? ?? ?? ?? ?? ?????
  ???? ??? ???? ? ??? ??? ???? ??? ?? ???
  ????.
• ?? ??. - ?? ???? ???? ?? ??, ???? ??? ??? ??
  ??? HPLC ???? ?? ?? ???? ??. - ??? ????,
  baseline ??? ??? ?? ?? ?? ??? ??. - ??? ?? ???
  ??? ??? ??(gradient elution)? ??.

39
Refractive index detector

• ??. - Reference cell? sample cell? ??? ??? ???
  ??? ??? ???? ??, ??? ??? ?????? deflect ??
  ???? ??? ???. - ??? ??? ?? ?? ? 1000? ??, ????
  ???? ???? ??? ?? ??? ??? ???? ???? ??. -
  ??? ?? ??? ???? ?? ??? ???? ??, ?? ??? 0.01 oC?
  ?? ???? ??.
• ?? ??. - ???? ??? ????? ?? ?? ??? ??? ? ???,
  ??? ?? ??? ?? ???? ???? ??, ??? ??? ?? ?? ??
  ????? ??? ???? ?? ??? ????? ??.

40
Electrochemical detector

• ??. - ?? ??? ?? ?? ??? ????? ??? ?? ???. -
  ?? ?? ??, ??? ?? ????, ???? ??? ?? ????,
  ??, ????, ??? ???? ??? ?? ??.
• ??. - ??? ? ?? ?? ??? ???? ?? ??? ??, ?? ???
  ?? ??? ?? ??? ? ??. - ???? ?? ?? ????? ??
  ?? ??? ????, ??? ?? ? ?? ??? ??. - ? ????
  ?? ??? ?? ??? ??.

41
Fluorescence detector

• ??. - ???? ???? ??? ??? ??? ?(??)? ???? ??.
  - ??? ??? ?? ? ? ?? ??? ??? ? ? ?? ???? ?? ?
  ?? ??? ??? ?? ???? ???? ? ??. - ??? ?? ???, ??
  ??? ?? ??? ??? ?? ??? ?? ?? ?? ??.
• ?? ??. - Uv detector?? 100 1000 ? ?? ????
  ??. - ???, ??, ????, ???, ?? ?? ??. -
  Polycylic armatic, Aflatoxin?, Amino acid?.

42
Troubleshooting(Pressure)

• ??. - Frit ??. - ?? ??. - ??? ??.
• ??? ?? ?? ?? ??. - ?? ?? ?? ?? ??? ?? ?? ??,
  ??? ??? ??? ??, ??? ?? ???
  ??. - ??? ?? Frit ?? ??. - Frit ?? Frit
  ?? ??.
• ?? ??? ?? ??. - ?? ?? ?? ??(Guard column). -
  ?? ??. - ??? ?? ??. - ??? ??.

43
Troubleshooting(Peak split)

• ??. - ? ?? ????? ???? ? ?? ??? ?? ??? ? ??
  ???.
• ??. - ?? ?? - ?? ??? ?? ?? ??? ?? ??
  ??? ???? ?? ??? ?? ? ???(Broadening) ?? ??
  ??? ??? ?? ? ??. - ?? ? ??? ????? ??.
• ?? ??? ?? ??. - ????? ??? ?? ?? ? ?? ?? ?? ??
  ?? ? ?? ?? ?? frit ??. - ??? pHgt7 ???
  ??? ?? ??? ?? ??(Void)?? ???, ?? ?? ???? ??
  ????. - ?? ?? ??? ??? ?? ?? ?? ??? ???? ??.

44
Troubleshooting(Peak tailing)

• ??. - 2? ??? ?? - ?? ?? ??(void volume).
  - ?? ??. - ?? ??.
• ?? ??? ?? ??. - ??? ?? ?? ??? pH? ??? ???
  2? ?? ??. - ?? ?? ?? ??? ??? ?? ?? ??? ??
  ??? ?? ?? ??. - ?? ??? ??. - ?? ???
  ?? ?? ??, ?? ??.

45
Troubleshooting(Retention time)

• ?? - ?? ??. - ?? ??.
• - ??? ???? ???? ??. - ???, ?? ??.

• ??? ?? ???(???) - ??? ??? capacity factor,
  selectivity,tr ??. - ?? ??. - ??? ???- lot
  number ??. - ???? ?? ?? ??? ??.

• ??? ?? ???(???) - ?? ?? ??? ??(??). - ???? ??
  ??. - ??? ???? ???? ??. - ???, ?? ??.

46
Eluotropic series

• ??. - ??? ???? ?? ??? ???? ? ?? ??? ??? ???
  ?? ? ??? ???. - ??? ??(eluent strength, ?o
  )? ??? ?? ???? ?? ??, ?? ? ?? 0?? ???.
  - ????? ???? ??? ??? ??? ? ?? ????
  ?? ???.
• ??. - ???? ??? ???? ??? ?? ??? ??? ?? ??? ??
  ?? ??.- ??? ??? ??? ??? ?? ????, ?? ???? ???
  ??? ??? ?? ??? ??? ???? ?? ??? ??? ??? ????
  ?? ????.

47
Table 1. Eluotropic series.
Solvent Fluoroalkanesn-Pentanei-O
ctanen-Heptanen-DecaneCyclohexaneCyclopentane
Carbon disulfideCarbon tetrachloride1-Chloropent
anei-Propyl chlorideToluene1-ChloropropaneChlr
obenzene BenzeneBromoethaneDiethyl
etherChlroform
Solvent DichlromethaneTetrahydrofu
ran1,2-Dichloromethane2-ButanoneAcetoneDioxane
Ethyl acetate Methyl acetate1-PentanolDimethyl
sulfoxideAnilineNitromethaneAcetonitrilePyridi
ne 2-PropanolEthanolMethanol1,2 Ethanediol
48
Practical analytical method development

• ????. - ?? ??? ??? Methyl, butyl, octyl,
  octadecylsilane, phenyl, amine, cyano column
  ?? ??, ???? ??? alkyl silane ???? ??? ??,
  retention time, component elution? ?? ??. - ???
  ?? ? ?? octadecylsilane? ???? retention time ? ??
  ? ?? ???? ?? ? ???? chain? ? ?? otyl silane
  column? ? ???. - ?? ??? ???? resolution,
  ????, ???? ?? ?? retention time? ?? ? ??
  ??.
• ???? ??. - ?? HPLC? ???? ?? CH3CN, CH3OH,
  Tetrahydrofuran(THF)? ? ? organic modifier?
  ???? ??. - ???? target? ???? ?? ?? ?? ? ???
  organic modifier? ???? ??? ???.

49
Practical analytical method development
THF
MEOH
ACN