Vectores y su dise

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Vectores y su diseño
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Temas

• Vectores basados en plásmidos.
• Vectores basados en M13.
• Vectores basados en ?
• Construcción de una Genoteca y vectores de álta
  capacidad.

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Vectores basados en plásmidospBR322

• Nomenclatura pBR322.
• Tamaño 4363pb. Capacidad hasta 10.000
• Contiene dos marcadores de resistencia Amp y
  Tet.
• Es un plásmido multicopia. Pueden encontrarse
  hasta 15 copias por célula. Utilizando
  cloranfenicol, puede aumentarse hasta 1000-3000.

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El mapa de pBR322
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pUC18 un plásmido avanzado

• Desciende de pUC8, a su vez de pBR322.
• Conserva el origen de replicación y ampR.
• La secuencia del marcador se ha alterado para
  eliminar los sitios de restricción.
• Estos se encuentran insertos en la secuencia de
  lacZ.
• Ventajas 500-700 copias/célula. Identificación
  directa empleando X-gal. Múltiples sitios para
  clonar (sitios de restricción).

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Mapa de restricción de pUC18
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El plásmido pGEM3
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Vectores basados en M13

• El genoma de M13 consiste de 6,4Kb, de los que la
  mayoría corresponde a 10 genes empaquetados.Todos
  son esenciales.
• Queda una región intergenica de 507 nucleótidos
  que tiene el origen de replicación ori.
• A pesar de estas dificultades, el hecho de que
  este vector se encuentra en forma monocatenaria
  lo hace muy atractivo para procesos de clonaje.

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Estrategias para desarrollar vectores basados en
M13

• Los vectores MP13mp contienen el gen LacZ.
• Los más modernos (mp7) tienen insertado un
  polilinker simétrico.
• O en su caso, polilinkers que permiten incorporar
  fragmentos con extremos cohesivos distintos,
  asegurando la orientación de la inserción
  (mp8/9).
• Existen otros vectores mixtos con plásmidos
  phagemids o fagómidos.

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Vectores en base al bacteroiófago ?

• La creación de vectores en este caso pasa por la
  resolución de dos problemas 1) El tamaño máximo
  permitido es de 52kb. 2) El genoma es tan grande
  que limita el uso de las endonucleasas.
• A pesar de ello, se han diseñado vectores ?,
  especialmente adaptados para clonar segmentos
  grandes de DNA.

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Estrategias para confeccionar vectores ?

• Se pueden eliminar sitios de restricción
  inadecuados por selección.
• Hay segmentos del genoma que se pueden eliminar.
  Existe una zona (b2) entre kb20 y 35 que puede
  eliminarse sin afectar la viabilidad. Por tanto,
  hay un margen de hasta 18kb.

Capsidia Zona b2
Reg tempr, Sint.DNA, Reg tardía, Lisis
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• Los vectores de inserción tienen toda o una
  parte de la zona b2 eliminada, y contienen un
  solo sitio de restricción para cada enzima en esa
  zona. El DNA se corta, el fragmento se inserta, y
  se procede a la ligación.
• Dos buenos ejemplos son ?gt10, un vector que
  tiene un solo sitio EcoR1 en el gen cI, y ?ZAPII,
  que tiene un polilinker insertado en el gen lacZ.

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• Los vectores de sustitución tienen dos sitios
  de restricción que flanqueanun segmento de DNA
  que es sustituido por el DNA que se va a clonar.
  Estos vectores se emplean para incorporar
  fragmentos mas grandes que los vectores de
  inserción. La selección de los recombinantes
  normalmente se realiza por el tamaño del DNA.
• Dos ejemplos de este tipo de vectores son ?EMBL4
  y ?GEM11 y 12.

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Experimentos con vectores ?

• El bacteriófago ? puede emplearse como un
  plásmido circular, cortándose por un lugar,
  insertando el DNA y luego introducirlo por
  transfección.
• Otra opción es utilizar DNA linearizado. En este
  caso, se pueden cortar los fragmentos, liberarlos
  y ligarlos con DNA para clonar. La ligación da
  lugar a concatenaciones que son especialmente
  indicadas para empaquetamiento in vitro. Así se
  consiguen muchos mas clones.

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Vectores ? de alta capacidad

• Siempre y cuando un fragmento de DNA tenga un
  tamaño entre 37 y 52 kb y esté flanqueado por
  secuencias cos, puede ser empaquetado in vitro.
• Un cósmido es básicamente un plásmido que tiene
  un marcador de selección, un origen de
  replicación y una secuencia cos.
• El cósmido se corta con una endonucleasa, y se le
  inserta un fragmento.
• Considerando que el DNA es de tamaño adecuado, se
  puede empaquetar in vitro.
• Las células infectadas no desarrollan placas,
  pero pueden seleccionarse en base al marcador del
  plásmido,
• La capacidad de un cósmido es de hasta 40kb.

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Bibliotecas genéticas o genotecas

• Son colecciones de vectores que colectivamente
  contienen todos los fragmentos de un organismo.
• Cuantos clones hacen falta para albergar un
  genoma?
• N ln(1-P)/ln(1-a/b)
• P la probabilidad de que un gen esté presente, a
  es el tamaño medio de fragmento y b es el tamaño
  total del genoma.

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Valores de N Tabla por especies
Especie Genoma (pb) nº clones
de
17kb de 35kb E.coli 4 x 106
820 410 S. cerevisiae 1.8 x 107
3225 1500 Arroz 5.7 x 108 100000
49000 Humanos 3.2 x 109 564000 274000