Diapositiva 1

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Seminario de Purificación de Proteínas
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Material de Partida
-Proteína recombinante -soluble (extracelular,
periplasmatica, etc) -cuerpos inclusión (antes
o luego de replegado) -Proteína
extractiva -tejido -células -cultivo
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Grado de pureza requerido

• Muy alto ( gt99)
• Uso terapéutico
• Alto (95-99 )
• Estudios estructurales (cristalografía de rayos
  X, determinación de características
  fisicoquímicas).
• Moderado (lt 95)
• Pegado de Ac a matriz de inmunoafinidad.
• Marcación del Ac para su uso en inmunoanálisis,
  inmunohistoquímica.

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Métodos de clarificación

• Centrifugación-Ultrafiltración
• Para eliminar agregados insolubles, restos
  celulares, lipoproteínas y otros materiales
  lipídicos. (ej.15 min a 10000g, en frío).
• Filtración (0.22-0.40mm)
• Remueve material micro particulado. Es necesario
  antes de cualquier paso cromatográfico en FPLC
  para preservar la columna de cromatografía
  (especialmente las preempaquetadas).

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Enriquecimiento

• Objetivo aumentar la cc relativa de la proteína
  de interés / eliminación parcial de
  contaminantes.
• Diálisis
• Precipitación
• Salina (salting-out) la sal extrae agua de
  solvatación de la proteína
• Alcohólica (bajo constante dieléctrica entonces
  baja la capacidad de solvatación del solvente).
• Isoeléctrica ( pH pI )
• Crioprecipitación (crioglobulinas)

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Métodos cromatográficos

• Métodos adsortivos
• Afinidad, pseudoafinidad, interacción
  hidrofóbica, interacambiadores iónicos, etc
• Concentran la muestra
• Se emplean en los primeros pasos de purificación
• Métodos no adsortivos
• Exclusión molecular
• Diluyen la muestra
• Generalmente se emplean al final

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Cromatografía de intercambio iónico

• Principio se basa en la adsorción reversible que
  existe entre una molécula con una carga
  determinada y un grupo de carga opuesta
  inmovilizado en la matriz.
• Grupos cargados unidos a la matriz
• QAE -CH2-N-(CH3)3 Aniónico fuerte
• DEAE -O-CH2-CH2-NH-(C2H5)2 Aniónico débil
• SP -CH2-SO3- Catiónico fuerte
• CM -O-CH2-COO- Catiónico débil
• La característica de intercambiador fuerte o
  débil hace referencia a la variación de
  ionización (capacidad) de la matriz con el pH, no
  a fuerza de union.

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Cromatografía de intercambio iónico

• La matriz debe tener poro grande para no actuar
  como tamiz molecular (Sepharose Fast Flow, límite
  de exclusión de 4 x 106)
• Siembra de la muestra
• En el buffer de estabilización, baja fuerza
  iónica (Ej Tris 20 mM)
• Métodos de elución
• Variando el pH de la fase movil.
• Aumentando la fuerza iónica de la fase movil (ej
  ClNa 1M)

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Cromatografía de intercambio iónico

• Ventajas
• Alta capacidad
• Alta resolución
• Paso concentrador puedo sembrar un gran volumen
  para luego eluirlo en un menor volumen
• Desventajas
• Ocasionalmente las condiciones de la corrida
  pueden afectar la actividad de la proteína

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Cromatografía de intercambio iónico

• Cromatograma representativo

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Cromatoenfocado
Fundamento separa biomoléculas de acuerdo a su
pI Puede ser analítica o preparativa

• Ventajas
• Alta resolución (hasta diferencias de 0.02
  unidades de pH)
• Desventajas
• - Puede desnaturalizar las proteínas por la
  cercanía al pI

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Interacción Hidrofóbica- Fase reversa

• Principio técnicas adsortivas que se basan en
  interacción de tipo hidrofóbica entre la matriz y
  las proteínas
• Grupos hidrofóbicos unidos a la matriz de sílica
• Butilo (Butil Sepharose 4 FF)
• Octilo (Octil Sepharose CL-4B)
• Fenilo (Phenyl Superose)

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Interacción Hidrofóbica

• Siembra
• Alta fuerza iónica (gt 1M SO4(NH4)2)
• Método de elución
• Disminuyendo la fuerza iónica de la fase movil
  (20 mM fosfato de sodio).

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Interacción Hidrofóbica

• Cromatograma representativo

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Interacción Hidrofóbica

• Ventajas
• Alta capacidad
• Alta resolución
• Al ser de naturaleza adsortiva se logra
  concentrar la muestra.
• Desventajas
• La alta fuerza ionica necesaria para el pegado
  puede desnaturalizar las proteínas (ver
  precipitacion)
• No recomendada cuando se quiere conservar
  actividad biológica

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Fase reversa

• Principio es el mismo que para interacción
  hidrofóbica.
• Diferencias entre FR y IH
• Las matrices de FR están mucho mas sustituidas
  que las de IH (hay mayor numero de grupos
  hidrofóbicos por gramo de matriz).
• Matrices de Silica sustituidas.
• La interacción es mas fuerte que la que se logra
  en IH por lo tanto para la elución son necesarias
  condiciones mas drásticas (sv no polares).

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Fase reversa

• Fases móviles
• Deben tener un bajo pH (lt 3) para evitar
  ionización de silanoles libres. Se usa TFA 0,1
• Siembra
• Muestra en un solvente polar (ej agua TFA 1)
• Método de elución
• Disminuyendo la polaridad de la fase móvil (ej
  aumento la concentración de Acetonitrilo)

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Fase reversa

• Ventajas
• Alta resolución ( se utiliza mucho en HPLC
  analítico, ej mapeo de peptídico)
• Gran volumen de muestra (técnica adsortiva)
• Desventajas
• Dadas las condiciones de elución no es
  recomendado como método de purificación cuando
  hay que mantener la actividad biológica de la
  proteína
• Requiere solventes de alta pureza.

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Exclusión molecular

• Principio se basa en la diferencia de tamaño y
  forma de las proteínas en la muestra.
• Ideal para ultimo paso de purificación
• El volumen de muestra es bajo ( al no ser técnica
  adsortiva el volumen de siembra es limitado)
• Dejo en el buffer de almacenamiento (la
  composición del buffer no altera la resolución)
• La siembra es independiente de la cc de muestra
  (por debajo de 50 mg/ml)

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Exclusión molecular

• Siembra puedo sembrar hasta un 5 del volumen
  total de la columna.

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Exclusión molecular

• Ventajas
• La elución no depende de la composición del
  buffer, esto permite el cambio de buffers.
• Desventajas
• Diluye la muestra (mayor tamaño de poro, mayor
  dilución).

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Cromatografía de Afinidad-pseudoafinidad

• Principio se basa en la interacción específica
  entre dos moléculas (Ag-Ac, Enz-Sustrato,
  Lectina-HC, Metal-aa). Una de las moléculas, el
  ligando, se inmoviliza en la resina.

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Control de la purificación

• Pureza
• SDS-PAGE
• Cuantificación
• Bradford, Lowry, Abs 280 (Ac puro), relación
  280/260
• SDS-PAGE ST cc (Ac impuro, estimado)
• Actividad Ac
• Comparar resultados del Ac antes y después de
  purificar, normalizando con la concentración de
  Ac.

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OPTIMIZACIÓN
OBJETIVO

• Requerimientos de
• pureza
• masa
• actividad
• Velocidad/costo del proceso
• Scaling up

Esquema de purificación

• REGLAS para la ubicación de los procesos
  cromatográficos en una secuencia racional
• Las matrices más costosas se ubican dentro de
  los últimos pasos de la secuencia (se evita
  deterioro por alta cc de contaminantes).
• Técnicas adsortivas en primer paso concentran
  la muestra, alta resolución.
• Exclusión molecular como último paso diluye la
  muestra y no tiene alta resolución
• Interacción hidrofóbica puede realizarse luego
  de precipitaciones salinas.

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FPLC(Fast Protein/Peptide/PolynucleotideLiquid
Chromatography)
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Características generales

• Trabajo a presiones inferiores que las del HPLC
  (10-20 atm)
• Columnas de vidrio y tubuladuras de plasticas más
  resistentes a la corrosion por sales, pH, sv
  organicos.
• Compatible con actividad biológica
• Utilizo matrices con tamaño de particulas
  pequeño, a base de agarosa (Superosa, Sepharosa).

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Equipamiento básico
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• Ventajas FPLC
• Alta recuperación de la actividad biológica
• Se utilizan condiciones de corrida no tan
  drásticas como las usadas en HPLC.
• Compatibilidad con buffers salinos
• Alta resolución
• El tamaño de las partículas disminuye mucho
  entonces aumenta la cinética de
  adsorción/desorción (mayor número de platos
  teóricos).
• Alta Reproducibilidad
• Desventajas
• Equipamiento costoso

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Purificación de Anticuerpos
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Características de las inmunoglobulinas
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Para qué purificar un Ac?

• Para su posteriór marcación con
• Enzimas (HRP), Biotina
• Fluorocromos (FITC)
• Radionucleidos ( I125)
• Para utilizarlo como ligando
• en cromatografía de inmunoafinidad
• Para utilizarlo en una inmuno precipitación

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Material de origen
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Cuándo no es indispensable purificar?

• Cuando se usa como primer anticuerpo en un ensayo
  de interacción primaria indirecto (ej IFI,
  ELISA, WB)
• Cuando se usa en un ensayo de interacción
  secundaria (OJO limitación en el
  antígeno/concentración)

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Variables a tener en cuenta

• Material de partida
• Concentración relativa
• Grado de pureza requerido (esta relacionado con
  el uso que le voy a dar al Ac)
• Especie del Ac, clase y subclase. Importante al
  usar proteina A/G algunos isotipos no se pegan
  (IgM, IgG1 de raton)

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Ejemplos

• Purificación de Mab desde LA para marcación
• Centrifugación en frío, separo capa lipídica y
  células
• PP sulfato de amonio 50 saturación
• DEAE a pH 8, eluyo con gradiente salino (ideal
  FPLC)
• Purificación de Mab desde sobrenadante para
  pegado a columna de afinidad
• Centrifugación en frío, separo células, grumos
• Unión a Proteína A/G

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Purificación Mab desde líquido ascítico
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Purificación de Mab desde sn.cultivo
669
140
66
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• La purificación por inmunoafinidad se puede
  dividir en 3 pasos
• Preparación de la columna de inmunoafinidad
• Activación de la matriz
• Pegado de la proteína en forma covalente
• Bloque de sitios libres
• Unión específica del Ag al Ac de la matriz
  (ligando-ligante)
• Elución del Ag (ligante)

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• Factores que influyen en inmunoafinidad
• Riqueza inicial del antígeno en el medio
• Constante de afinidad del Ac (gt 106 M) utilizado
  como ligando
• Facilidad de elución del Ag (dependerá del tipo
  de interacciones que exista entre Ag/Ac)

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• Matrices
• No deben impedir el flujo de la proteína a
  purificar
• Deben ser estable a pH extremos y altas cc
  salinas
• Ej Sepharosa 4B (la más simple), Sepharosa CL
  (cross-linked, mayor resistencia), Sepharosa Fast
  Flow, Sepharosa High Performance (menor tamaño de
  partícula). Todas de Pharmacia.

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RESINAS ACTIVADAS Sepharosa 4B-CNBr para
ligandos con grupos amino libres Sepharosa 4B
EAH/ECH con espaciadores de 10/9 C para unir por
los grupos amino o carboxilos Epoxy-activated
Sepharose 6B espaciador hidrofílico prolongado
para unir a traves de grupos OH, NH2 o SH. Los
brazos espaciadores evitan los inconvenientes
estéricos que podrían ocurrir si el ligando
estuviera unido directamente a la matriz.
R-NH2
NH-R
BrCN
C N
O-CNH2
Isourea
Sepharosa 4B
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Ligando Afinidad (Ka) por la sustancia a
purificar debe encontrarse dentro de los rangos
104 - 108 M-1 Si es menor de 104 se desorberá
de la matriz en forma inespecífica, si es mayor
de 108 será muy difícil desorberla.
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• Elección del ligante, ej. Anticuerpos
• Ac policlonal purificado por inmunoafinidad
• Difícil de eluir, pegan con alta avidez
• Se utilizan cuando se generan a partir de
  péptidos sintéticos o contra zonas específicas de
  una proteina.
• Ac monoclonales
• Reactivos ilimitados. Puedo elegir usar Ac de
  alta afinidad.
• Pool de Ac monoclonales (ideal!)

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Ligantes Grupo-Específico Aquellos grupos de
adsorventes que tienen afinidad por un grupo de
sustancias relacionadas, más que por una
sustancia en especial. Proteina A(estafilococo)
región Fc de IgG y moléculas relacionadas con
distinta afinidad Proteína G (estreptococo)
Similar a la proteína A, pero con afinidades
diferentes. IMAC (Immobilized Ion Affinity
Chromat)SephHP ligada covalentemente a un
quelante de cationes divalentes (ácido
iminodiacetico) que puede ser Ni, Zn, Cd, Fe,
etc. Para purificar proteinas recombinantes
modificadas con colas de aminoácidos (Ej Ni
histidina).
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VENTAJAS No hay restricción por volúmen Paso
concentrador (si se usa columna) Especificidad Pur
eza del producto final DESVENTAJAS Precio
(alto) Condiciones de elución drásticas Ligando
específico no disponible o inadecuado
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Preparación de la columna de inmunoafinidad

• Existen tres formas de pegar el Ac a la matriz
• Matrices con proteína A/G reactivo
  entrecruzante
• Los Ac quedan alineados por el Fc
• El reactivo entrecruzante más usado es el DMP
• Matrices activadas
• Utiliza reactivos bifuncionales (ej
  glutaraldehido, bromuro de cianógeno) para
  activar la matriz.
• La reacción entre matriz activada y Ac se realiza
  a pH alcalino (si une por parte proteica)
• Anticuerpo activados (ej puede unirse por los
  HdeC Affi-Gel Hz Hydrazide, une los HdeC de la Ig
  previamente oxidados)

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Cromatografía de Afinidad

• Union del Ag a la columna de inmunoafinidad
• La cinética de la interacción Ag/Ac-matriz es
  distinta a la de la reacción en solución
• Se tarda mas tiempo en llegar al equilibrio.
• Existen 2 metodologías
• En batch
• En columna

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Elución en Inmunoafinidad
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Inmunoafinidad

• Corrida representativa

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Control de la purificación

• Pureza
• SDS-PAGE
• cuantificación
• Bradford, Lowry, Abs 280 (Ac puro), relación
  280/260
• SDS-PAGE ST cc (Ac impuro, estimado)
• Actividad Ac
• Comparar resultados del Ac antes y después de
  purificar, normalizando con la concentración de
  Ac.

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Purificación desde sn. cultivo
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Almacenamiento de Ac

• Sueros, líquido ascítico y sobrenadantes de
  cultivo se pueden almacenar a 20C.
• Anticuerpos purificados
• Almacenar en soluciones buffereadas e isotónicas
  (PBS, pH7) y en lo posible en altas cc gt1 mg/ml.
• Alicuotar para evitar formación de agregados por
  continuo congelado/descongelado.
• El almacenamiento a bajas cc requiere agregado de
  1 BSA.
• Azida sódica en cc 0,02 como conservante.